HPLC法測定人血漿中雙嘧達莫的濃度

李曉苗，李源，謝永宏（1.第四軍醫大學西京醫院內分泌科，西安市7100；.第四軍醫大學口腔醫院麻醉科，西安市 7100；.第四軍醫大學唐都醫院呼吸科，西安市 71008）

雙嘧達莫又名潘生丁，因其具有擴張冠狀動脈及抗血小板聚集功能，臨床主要用于預防和治療心絞痛、心肌梗死和血栓栓塞性疾病[1，2]。隨著雙嘧達莫在臨床的廣泛應用，對其研究也不斷增多，筆者建立了一種簡單、快速、靈敏的高效液相色譜法測定雙嘧達莫的血藥濃度，可用于雙嘧達莫臨床血藥濃度測定及藥動學、生物等效性的研究。

1 材料

1.1 儀器

10A series高效液相色譜儀，包括LC-10Avp二元泵、SPD-10Avp紫外檢測器、Class-VP工作站（日本島津公司）；TG16-WS高、低速離心機（上海滬湘儀器有限公司）；渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

雙嘧達莫標準品（中國藥品生物制品檢定所，純度：99%）；內標：地西泮注射液（上海旭東海普藥業有限公司，規格：2 mL∶10 mg，批號：070102）；乙腈為色譜純，三乙胺、冰醋酸、醋酸銨均為分析純；所有試驗用水均為雙重蒸餾水；空白血漿由第四軍醫大學西京醫院輸血科提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS C18（50 mm×4.6 mm，5 μm），ODS預柱（10 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈∶0.02 mol·L－1醋酸銨（含0.25%三乙胺，冰醋酸調pH值至5.6）＝40∶60；流速：1 mL·min－1；檢測波長：283 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。

2.2 雙嘧達莫標準溶液的制備

準確稱取雙嘧達莫標準品12.5 mg，置于25 mL容量瓶中，加入適量甲醇使之溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得濃度為500 μg·mL－1的雙嘧達莫標準貯備液。將該貯備液以甲醇稀釋，制備成濃度分別為0.4、1.0、2.0、5.0、10、20、40、100、200 μg·mL－1的雙嘧達莫標準溶液。

2.3 內標溶液的制備

精密量取地西泮注射液1 mL，置于50 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容，得濃度為100 μg·mL－1的內標貯備液。

2.4 血漿樣品的處理

量取空白血漿0.4 mL，置于10 mL具塞離心管中，加入0.1 mol·L－1氫氧化鈉（NaOH）溶液 0.5 mL，渦旋混合30 s后加入內標溶液10 μL，渦旋混合30 s。加入乙醚3 mL渦旋混合3 min，4 500 r·min－1離心10 min。分離有機層，室溫下N2吹干。殘渣加入流動相100 μL渦旋混合30 s使之溶解，10 000 r·min－1離心10 min，取上清液20 μL進樣分析。

2.5 標準曲線的制備

量取空白血漿0.4 mL，置于10 mL具塞離心管中，分別加入不同濃度雙嘧達莫標準溶液10 μL，混勻，使其血藥濃度分別為10、25、50、125、250、500、1 000、2 500、5 000 ng·mL－1，按“2.4”項下方法操作測定，每一濃度進樣3次，取平均值。以濃度（X）為橫坐標，雙嘧達莫與內標峰面積比（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為Y＝0.006+0.036X（r＝0.999 0），結果表明，雙嘧達莫血藥濃度在10～5 000 ng·mL－1范圍內線性關系良好。血漿中雙嘧達莫的定量下限為10 ng·mL－1。

2.6 方法專屬性考察

在本色譜條件下，血漿中內源性物質不干擾待測物和內標物的測定，并且峰形良好。雙嘧達莫、內標地西泮保留時間分別約為8、17 min。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+內標；C.空白血漿+雙嘧達莫標準品+內標；1.雙嘧達莫；2.地西泮Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+diazepam；C.blank plasma+dipyridamole control+diazepam；1.dipyridamole；2.diazepam

2.7 回收率試驗

分別在0.4 mL空白血漿中加入低、中、高3種濃度的雙嘧達莫標準溶液10 μL，混勻，使其血藥濃度分別相當于25、500、5 000 ng·mL－1，按“2.4”項下方法操作，將雙嘧達莫峰與內標峰面積之比（Y）代入標準曲線計算雙嘧達莫血藥濃度，并以測得值與加入值之比計算方法回收率，結果見表1。另以流動相配制相應系列濃度的雙嘧達莫溶液，不經提取直接測定，以此為標準，將2組峰面積相比，計算得雙嘧達莫提取回收率，結果見表1。

表1 回收率及精密度試驗結果（n＝5）Tab 1 Results of precision and recovery test（n＝5）

2.8 精密度試驗

同“2.7”項下方法制備，使血漿中雙嘧達莫溶液濃度分別為25、500、5 000 ng·mL－1，每個濃度平行制備5份樣品，按“2.4”項下方法操作。進樣分析計算日內精密度；依上述方法，連續測定3 d，計算日間精密度，結果見表1。

2.9 穩定性考察

同“2.7”項下方法制備，使血漿中雙嘧達莫溶液濃度分別為25、500、5 000 μg·mL－1，于－20 ℃冷凍保存，反復凍融3次，分別按“2.4”項下方法操作，測定血漿中雙嘧達莫濃度，考察其穩定性，結果表明血漿中雙嘧達莫在－20℃冷凍保存，反復凍融3次后穩定性符合要求（RSD均＜6%）。同“2.7”項下方法制備上述3種濃度的標準血漿，按“2.4”項下方法處理后分別于0、6、24 h時進樣測定，結果表明處理后的血漿中雙嘧達莫在24 h內穩定性良好（RSD均＜6%）。同“2.7”項下方法制備上述3種濃度的標準血漿，分別于0、6、24 h時按“2.4”項下方法處理標準血漿，進樣測定，結果表明室溫下血漿樣品穩定性良好（RSD均＜4%）。

3 討論

在選擇流動相時，分別選用了甲醇-磷酸二氫鈉、乙腈-磷酸二氫鈉、甲醇-醋酸銨、乙腈-醋酸銨，經比較發現選用乙腈-醋酸銨時峰形較好，與血漿中內源性雜質、內標可完全分離，分離度大于2，且保留時間適宜。

本試驗篩選了大量的內標物，結果發現流動相為乙腈-0.02 mol·L－1醋酸銨（含0.25%三乙胺，冰醋酸調pH值至5.6）時，選用地西泮為內標與雙嘧達莫的分離度最好，保留時間適宜。

對于雙嘧達莫的提取方法，分別選用乙醚、乙酸乙酯、氯仿為提取劑，經過比較，乙醚提取率較高，且雜質較少，峰形較好，易于N2吹干；乙酸乙酯和氯仿提取回收率較低，雜質較多，不易于N2吹干，比較耗時。同時考察了乙醚的用量對回收率的影響，發現乙醚用量為3 mL時比1.5 mL提取率高，而與5 mL相比無顯著性差異。因此將乙醚定量為3 mL。本法使用乙醚1次提取即可使回收率達85%以上，節省了試驗時間。在提取過程中，將樣品分別振蕩1、3、5 min，結果表明，振蕩3 min提取率高于1 min，與5 min相比無顯著性差異。

本文建立的高效液相色譜法測定雙嘧達莫血藥濃度準確、靈敏、特異、穩定，適用于雙嘧達莫在人體內的藥動學和生物利用度研究。

[1]陳新謙，金有豫，湯 光主編.新編藥物學[M].第15版.北京：人民衛生出版社，2003：268.

[2]Julie H，Robert AO.Drugs used in disorders of coagulation[A].Katzung BG.Basic&Clonical Pharmacology[M].8th edn.Beijing：The McGraw-Hill Companies，2001：564.