兩種糖尿病腎病大鼠模型的對比研究

孫惠力 程小燕 戈 娜 李順民

廣東省深圳市中醫院腎病科(518020)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN) 是糖尿病常見的慢性并發癥之一，在糖尿病人群中的發生率為20%～40%。在西方國家人群中，DN 已成為終末期腎功能衰竭(ESRD)的主要原因，也是糖尿病致命的主要原因[1]。我國DN發病率也呈逐年增多趨勢，越來越成為急待解決的腎臟病。然而，糖尿病腎病的病因和發病機制極為復雜，迄今尚未完全明了。在對DN 進行機制研究時，比較生物學的方法是很重要的研究手段，因此，建立適當的動物模型，不僅為研究糖尿病腎病的病因、發病機制和病理生理改變提供重要的線索，而且能促進藥物作用機制的研究和臨床藥物的開發。本文擬就兩種常用的糖尿病腎病大鼠模型進行比較。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠，體質量200～225g，購自廣州中醫藥大學醫學實驗動物中心。

1.2 試劑與儀器

鏈脲佐菌素(sigma，美國)，大鼠尿白蛋白測定試劑盒(Bethyl，美國)。逆轉錄擴增試劑盒、TaqDNA聚合酶(MBI，美國)，TRIzol試劑(Invitrogen life technologies，美國)。

大鼠代謝籠(Tecniplast，意大利)，ACCU-CHEK血糖儀(羅氏，德國)，無創大鼠血壓計(IITC，美國)，普通光學顯微鏡(Olympus，日本)，PCR擴增儀(Biorad，德國)，水平電泳儀(Biometro，美國)，GelDoc-It凝膠成像分析系統(UVP，美國)。

1.3 動物分組

將32只雄性SD大鼠(200～225g)隨機分成4組，A組:正常對照組(Con組，n=8)，注射枸櫞酸緩沖液；B組:單腎切除組(Nx組，n=8)，大鼠接受右側腎切除術，2周后腹腔注射枸櫞酸緩沖液；C組:糖尿病組(DM組，n=8)，單劑量腹腔注射STZ 60mg/kg體質量；D組:單腎切除+糖尿病組(DM Nx組，n=8)，大鼠接受右側腎切除術，2周后單劑量腹腔注射STZ 60mg/kg體質量。于開始注射STZ后72h后取大鼠尾靜脈血測血糖，凡血糖≥16.7mmol/L確定為糖尿病大鼠模型制作成功。觀察16周后收集標本。

1.4 標本的采集與檢測

每4周斷尾取血用血糖儀檢測血糖，每4周檢測血壓一次，每4周將大鼠置于代謝籠內收集24h尿標本，記錄尿量，按試劑盒說明書用ELISA法測定尿白蛋白水平。

1.5 腎臟組織病理學檢測

于16周后，大鼠戊巴比妥鈉麻醉后，剖開腹腔，摘除腎臟，稱重，用中性甲醛固定，經脫水，透明，石蠟包埋，切片2μm，行MASSON染色，光鏡觀察。

1.6 RT-PCR

按照TRIzol試劑說明提取總RNA，cDNA的合成參照逆轉錄擴增試劑盒操作程序進行。利用Primer5軟件設計目的基因引物，由上海博亞公司合成(表1)。反應體系50μL，反應條件:94℃預變性5min，94℃變性45s，52℃退火30s，72℃延伸45s，經35個循環后充分延伸10min。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統分析后，計算待測指標與內參GAPDH吸光度A的比值。

1.7 統計學

2 結 果

2.1 各組大鼠一般資料的比較

與Con組及Nx組相比較，DM組與DM Nx組大鼠的血糖、血壓、尿白蛋白、血肌酐及24h尿量均顯著升高，而血清白蛋白水平顯著降低。與DM組相比，DM Nx組的尿蛋白水平顯著升高，兩組之間其它指標差異無顯著性(表2)。

2.2 各組大鼠腎臟形態學的比較

與對照組相比，Nx組、DM組、DM Nx組大鼠腎重/體質量比值明顯增加，且DM Nx增加更明顯。與對照組相比，Nx組、DM組、DM Nx組大鼠腎小球體積明顯增加，但三者之間差異無顯著性。與對照組、Nx組相比，DM組、DM Nx組大鼠系膜基質明顯增多，且DM Nx增多更明顯。DM Nx大鼠腎小管間質出現局灶性纖維化，其余組腎小管間質未出現纖維化(表3，圖1)。

2.3 兩種糖尿病模型腎臟組織α-SMA 和E-cadherin mRNA表達水平的比較

表1 目的基因PCR引物序列

表2 各組大鼠的一般資料

表3 各組大鼠腎臟形態學的比較

圖1 各組大鼠腎臟病理改變(Masson,200×)

圖2 各組大鼠腎組織α-SMA mRNA的表達水平

RT-PCR結果顯示，與Con組及Nx組相比較，DM組與DMNx組大鼠腎臟組織內α-SMA mRNA的表達水平均顯著增高，且DM Nx組較

圖3 各組大鼠腎組織E-cadherin mRNA的表達水平

DM組升高更明顯；而E-cadherin mRNA的表達水平顯著降低，且DM Nx組較DM組降低更明顯(圖2、3)。

3 討 論

目前經典的1型大鼠糖尿病模型有兩種。一種是單純腹腔或靜脈注射鏈脲佐菌素建立模型；另一種是先將一側腎臟切除，然后腹腔或靜脈注射鏈脲佐菌素建立模型。前者操作相對簡便，但成模周期長，不利于動物實驗的進行；而后者單側腎切除后導致對例腎代償性肥大，腎臟肥大是糖尿病腎病的一個獨立危險因素，若再予鏈脲佐菌素注射，可以加速糖尿病腎病的形成，節省實驗時間[2-4]。有研究表明，單腎切除可以增加糖尿病大鼠腎小球濾過率，增加腎血漿流量，增加腎小球系膜基質擴張面積及腎小球硬化指數[5]。我們的研究發現，單腎切除再行鏈脲佐菌素誘導的糖尿病模型與單純腹腔注射鏈脲佐菌素的糖尿病模型相比較，腎重/體質量比值明顯增加，系膜基質明顯增多，并且16周后腎小管間質出現局灶性纖維化，表明單腎切除確實能加速糖尿病腎病的形成，并能更早的觀察到腎臟纖維化，有利于進行進一步的干預性研究。

腎小管間質纖維化是糖尿病腎病發展至終末期腎病必經的病理過程，而EMT是導致細胞外基質過度積聚及腎小管間質纖維化的關鍵性因素。EMT的兩個重要表現為①細胞極性的消失和細胞間連接的破壞，在此過程腎小管上皮細胞的部分表型丟失，如在細胞間緊密連接和黏附連接中起重要作用的ZO-1，E-cadherin表達下調；②在腎間質，小管上皮細胞表型完全丟失，轉變為表達α-SMA的肌成纖維母細胞。我們的實驗結果發現糖尿病大鼠腎小管上皮細胞存在α-SMA的表達，且腎小管上皮標志物E-鈣粘蛋白表達下降，表明早期糖尿病腎病大鼠模型腎小管內存在EMT。這與文獻報道一致[6]。單腎切除后STZ誘導的糖尿病腎病模型與單純STZ誘導的糖尿病腎病模型相比，小管間質更早出現纖維化，可能與腎小管上皮細胞轉分化程度更強有關。

[1]Lea JP,Nicholas SB.Diabetes mellitus and hypertension: key risk factors for kidney disease[J]. J Natl Med Assoc,2002,94(8 Suppl):S7-S15.

[2]Hostetter TH,Troy JL,Brenner BM.Glomerular hemodynamics in experimental diabetes mellitus[J].Kidney Int,1981,19(3):410-415.

[3]Steffes MW,Brown DM,Mauer SM.Diabetic glomerulopathy following unilateral nephrectomy in the rat[J].Diabetes,1978,27(1):35-41.

[4]O'Donnell MP,Kasiske BL,Daniels FX,et al.Effects of nephron loss on glomerular hemodynamics and morphology in diabetic rats[J].Diabetes,1986,35(9):1011-1015.

[5]Lopes GS,Lemos CC,Mandarim-De-Lacerda CA,et al.Effect of unilateral nephrectomy on renal function of diabetic rats[J].Histol Histopathol,2004,19(4):1085-1088.

[6]Thomas MC,Burns WC,Cooper ME.Tubular changes in early diabetic nephropathy[J]. Adv Chronic Kidney Dis,2005,12(2):177-186.