高效液相色譜法測定清涼散顆粒中連翹苷的含量

劉中麗 鄭仲毅

國藥控股深圳中藥有限公司(518029)

清涼散顆粒主要由連翹、金銀花、石膏、柴胡等藥物組成[1]，具有清熱解毒，涼血散結(jié)之功效，主要用于毒熱熾盛，具有高熱，口渴尿赤，便結(jié)，苔黃舌質(zhì)紅，脈弦數(shù)等實熱癥候有抗藥性或過敏反應的患者。現(xiàn)采用HPLC法測定該品種作為君藥——連翹的主要有效成分連翹苷的含量。

1 實驗材料

1.1 實驗材料

清涼散顆粒由國藥控股深圳中藥有限公司提供(批號:0901141、0901121、0901131、0810131、0812041、0812021、0812031、0810111、0809031、0809021)；缺連翹陰性對照由國藥控股深圳中藥有限公司提供；連翹苷對照品(中國藥品生物制品檢定所110821-200711)；乙腈為色譜純試劑；其他試劑為分析純。

1.2 儀器

高效液相色譜儀:Agilent 1100 Series 高效液相色譜儀；電子分析天平:瑞士Mettler AE-240及AE-200；KQ-250超聲波清洗器(功率250W，40kHz):昆山市超聲儀器有限公司；UV-2501PC紫外可見分光光度計:日本島津；YB-Z真空恒溫干燥箱:天津藥典標準儀器廠。

1.3 色譜條件及系統(tǒng)適應性

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水(22∶78)為流動相；檢測波長為228nm；流速為1.0mL/min。在此條件下連翹苷與其他組分達到基線分離，分離度＞1.5，理論板數(shù)按連翹苷峰計算應不低于3000[1]。

2 方法學考察

2.1 對照品溶液制備

精密稱取連翹苷對照品適量，加甲醇制成每1mL含連翹苷44μg的溶液，即得。

2.2 陰性對照溶液制備

取相當于供試品的量，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品裝量差異項下顆粒約5g，精密稱定，置具塞的錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，精密稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率40kHz)30min，放冷，再精密稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 實驗條件的確定

2.4.1 測定波長的選擇

取連翹苷對照品甲醇溶液，在200～400nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在200、228、277nm波長處均有吸收峰，由于200nm已靠近紫外吸收區(qū)的末端，不宜采用，比較了同一份對照品溶液注入液相色譜儀在228nm與277nm波長分別測定，結(jié)果在228nm波長處儀器的響應值是277nm的3倍。因此采用了228nm作為檢測波長。紫外光譜掃描結(jié)果見圖1。

2.4.2 專屬性

精密吸取對照品溶液、陰性對照溶液、供試品溶液10μL，分別注入高效液相色譜儀中，結(jié)果在連翹苷對照品色譜保留時間相應位置上無干擾，見圖2。

2.5 線性

精密稱取連翹苷對照品0.01487mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液(0.5948mg/mL)。精密吸取上述貯備液0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，置25mL量瓶中，加甲醇至刻度。注入液相色譜儀，平行進樣各兩次，以兩次峰面積平均值為縱坐標、連翹苷濃度(μg/mL)為橫坐標，在5.948～118.96μg/mL的范圍內(nèi)，得回歸方程為:Y=18.705X-0.5866，r=0.9999，見表1和圖3。

2.6 范圍

每袋含連翹以連翹苷(C29H36O15)計，不得少于1.5mg。范圍的考察可按表2來設(shè)計試驗。

2.6.1 范圍-準確度用的對照品貯備液制備

精密稱取連翹苷對照品0.01555g，置20mL量瓶，加甲醇適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液B；精密吸取貯備液B 5mL，置20mL量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液C。

2.6.2 范圍-準確度用的供試品溶液制備

精密稱取清涼散顆粒粉末(批號0901141，平均裝量9.7708g，含連翹苷2.16mg/袋)共12份，分別置具塞的錐形瓶中，精密加入上述范圍-準確度用的對照品貯備液適量(表3)，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率40kHz)30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

表1 線性回歸試驗結(jié)果

圖1 連翹苷對照品紫外光譜掃描圖

圖2 清涼散顆粒HPLC圖

圖3 連翹苷線性關(guān)系圖

圖4 不同色譜柱供試品色譜圖

2.7 精密度

表2 范圍試驗設(shè)計

表3 范圍-準確度試驗測定結(jié)果

表4 重復性試驗結(jié)果

2.7.1 重復性試驗

取同一批號的清涼散顆粒(批號0901141，平均裝量9.7708g)約5g，共6份，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備，測定，即得。結(jié)果重復性良好，見表4。

2.7.2 中間精密度試驗

取同一批號的清涼散顆粒(批號0901141)，分別由實驗員甲、乙、丙按同一方法在不同時間，用同一臺儀器測定，結(jié)果見表5。

2.8 準確度

2.8.1 加樣回收用對照品貯備液制備

精密稱取連翹苷對照品0.01027g，置20mL量瓶，加甲醇適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液A；另精密稱取連翹苷對照品0.01555g，置20mL量瓶，加甲醇適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液B；精密吸取貯備液B 5mL，置20mL量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液C。

表5 重現(xiàn)性試驗結(jié)果(n=2)

2.8.2 加樣回收供試品溶液的制備

精密稱取清涼散顆粒粉末(國藥控股深圳中藥有限公司，批號0901141，平均裝量9.7708g，含連翹苷0.2208mg/g)共15份，分別置具塞的錐形瓶中，精密加入上述加樣回收用對照品貯備液適量(表6)，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率40kHz)30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。結(jié)果見表6。

表6 準確度測定試驗結(jié)果

2.9 耐用性

2.9.1 不同色譜柱的考察

取同一供試品溶液，按擬定含量測定方法操作，考察在使用不同乙醇提取含量最低，其他提取方法結(jié)果基本一致，考慮方法一步驟簡便，故采用方法1。

表7 不同色譜柱的試驗結(jié)果

表8 不同柱溫的考察結(jié)果

表9 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

表10 樣品含量測定結(jié)果

表11 不同提取方法試驗結(jié)果(n=2)

表12 提取溶劑量試驗結(jié)果

根據(jù)試驗結(jié)果，提取溶劑選擇25mL。

表13 不同提取時間試驗結(jié)果

試驗結(jié)果表明不同超聲處理時間測得結(jié)果，30和40min大致相同，故選擇采用處理時間為30min。色譜柱的情況下，連翹苷含量測定結(jié)果不受影響的程度，結(jié)果見圖4及表7。

2.9.2 不同柱溫的考察

取同一供試品溶液，按擬定含量測定方法操作，考察本品在不同柱溫的情況下，連翹苷含量測定結(jié)果不受影響的程度，結(jié)果見表8。

2.9.3 被測溶液的穩(wěn)定性

取同一份供試品溶液，間隔一定時間分別進樣，記錄峰面積，測定結(jié)果見表9，表明被測溶液在7h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 含量測定

取不同生產(chǎn)批號的清涼散顆粒，按含量測定方法操作，測定，結(jié)果詳見表10。

3 討 論

3.1 提取方法的考察

方法1:取本品粉末5g，精密稱定，加甲醇20mL，超聲處理30min，濾過，取續(xù)濾液，即得。方法2:取本品粉末5g，精密稱定，加甲醇20mL，超聲處理30min，濾過，取續(xù)濾液10mL，加在中性氧化鋁柱(100～200目，4g，內(nèi)徑1cm)上，用稀乙醇70mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣用50%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加50%甲醇至刻度。方法3:取本品粉末5g，精密稱定，加甲醇20mL，超聲處理30min，濾過，取續(xù)濾液10mL，蒸干，殘渣加稀乙醇10mL使溶解，加在中性氧化鋁柱(100～200目，4g，內(nèi)徑1cm)上，用稀乙醇70mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣用50%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加50%甲醇至刻度。方法4:取本品粉末5g，精密稱定，加乙醇20mL，超聲處理30min，以下同方法3。方法5:取本品粉末5g，精密稱定，加甲醇20mL，加熱回流30min，濾過，取續(xù)濾液10mL，蒸干，殘渣加稀乙醇10mL使溶解，加在中性氧化鋁柱(100～200目，4g，內(nèi)徑1cm)上，用稀乙醇70mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣用50%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加50%甲醇至刻度。

按上述色譜條件進行測定，結(jié)果見表11。

3.2 提取溶劑量的考察

取本品粉末5g，精密稱定，分別加甲醇20、25、50mL，超聲處理30min，濾過，取續(xù)濾液，按上述色譜條件進行測定，結(jié)果見表12。

3.3 超聲處理時間的選擇

取本品粉末5g，精密稱定，分別加甲醇25mL，考察超聲處理10、20、30、40min，結(jié)果見表13。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(一部)[S].2005年版.北京:化學工業(yè)出版社,2005:117.