核運輸因子2在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的時空表達及其意義*

史 煜，陳春生，曹 亮，陳凌燕，謝 琳，唐仕波△

(1南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京第一醫(yī)院眼科，江蘇 南京 210006;2中山大學(xué)中山眼科中心眼科學(xué)國家重點實驗室，廣東 廣州 510060)

核運輸因子2(nuclear transport factor 2，NTF2)是一種小的二磷酸鳥苷 －Ran(guanosine diphosphate－Ran，GDP－Ran)附著蛋白，通過核膜孔復(fù)合體(nuclear pore complex，NPC)幫助 GDP－Ran進入到細胞核，維持跨膜間GDP－Ran梯度，這個跨膜梯度決定了mRNA、tRNA、轉(zhuǎn)錄因子等大分子轉(zhuǎn)運的方向，對各種生物細胞的功能起重要的支持作用。有研究發(fā)現(xiàn)，NTF2基因功能部分性缺失突變會導(dǎo)致果蠅復(fù)眼數(shù)量顯著減少，并且機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)受到很大影響，證實其與眼的發(fā)育和免疫系統(tǒng)有關(guān)[1]，我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)NTF2高表達與糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)呈負相關(guān)[2]。本研究擬觀察NTF2在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中表達變化及其分布特點，并探討其與血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在不同病程糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的變化趨勢，為進一步研究NTF2與糖尿病視網(wǎng)膜病變的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 糖尿病大鼠模型的建立

SPF級雄性Wistar大鼠，體重約180－200 g(廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供)，空腹12 h后單次腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，Sigma)65 mg·kg－1(溶于 10 mmol·L－1檸檬酸緩沖液中，pH4.5)誘導(dǎo)糖尿病模型，注射后72 h用Acute Check羅氏血糖儀(羅氏公司)，取尾靜脈血檢測血糖，血糖濃度大于16.8 mmol·L－1認為糖尿病誘導(dǎo)成功。同時取年齡匹配的正常大鼠作為對照組，腹腔注射檸檬酸緩沖液。注射后72 h隨機分為2周、1月、3月及6月組，每組10只。普通飼料喂養(yǎng)。動物處死前再次測量血糖及體重。

2 伊凡思藍(Evans blue，EB)灌注視網(wǎng)膜鋪片

取成模后2周、1月及3月糖尿病大鼠和對照組大鼠各4只，按4 mL/kg水合氯醛腹腔注射進行深麻醉，EB(Sigma)舌下靜脈注射循環(huán)2 h后，摘除眼球，4%多聚甲醛固定30 min，取視網(wǎng)膜，于視網(wǎng)膜周邊4個象限各剪1小口，將視網(wǎng)膜平鋪于載玻片上，水溶性封片劑封片。用激發(fā)光為546nm波長的濾光片在熒光顯微鏡(Zeiss，Axioplan2 Imaging)下觀察血管分布和形態(tài)并攝片。

3 RT－PCR檢測

收集與糖尿病大鼠不同時點鼠齡匹配的對照組(N2w，N1m，N3m，N6m)，成模 2 周、1 月、3 月及 6 月(D2w，D1m，D3m，D6m)的糖尿病大鼠的眼球各 6 只，分別提取每只大鼠雙眼視網(wǎng)膜總RNA:Trizol reagent(Invitrogen)裂解全視網(wǎng)膜組織，提取總RNA步驟按Trizol說明書進行，紫外分光光度儀(Eppendorf)測定RNA純度和含量。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提mRNA完整性。反轉(zhuǎn)錄和cDNA合成采用Fermentas Life Science公司的First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，按試劑盒說明操作。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，β －actin:上游引物5'－ ctcgaaccctaaggccaa －3'，下游引物5'－ tcacgcacgatttccctc－3'，產(chǎn)物長度302 bp;NTF2:上游引物5'－ taacgacagaacccaactagg －3'，下游引物5'－gaggaggaaacagcgtgact－3';產(chǎn)物長度353 bp;VEGF－A:上游引物5'－ atcctggagcgttcactg－3'，下游引物5'－ tcaccgccttggcttgtc －3'，產(chǎn)物長度165 bp。PCR擴增采用的2×Taq Platinum PCR MasterMix購自北京天為時代生物技術(shù)有限公司。PCR擴增(Eppendorf Mastercycler PCR儀)循環(huán)條件:預(yù)變性94 ℃ 5 min，然后94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min，共30個循環(huán)，72℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物5 μL行2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓120 V，時間50 min。凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。使用Gel analyser軟件測定各條帶IA值，以β－actin作為內(nèi)參照，NTF2及VEGF IA值分別與對應(yīng)β－actin IA值相比。以上實驗重復(fù)3次，取各組平均值。

4 視網(wǎng)膜切片NTF2免疫組化

取上述各時點糖尿病組和對照組大鼠，水合氯醛腹腔注射過量麻醉處死，取出眼球，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片。新鮮二甲苯脫蠟15 min，2次。通風(fēng)櫥晾干。蒸餾水水化10 min。0.01 mol/L檸檬酸緩沖液浸沒玻片，微波修復(fù)，自然涼至室溫。蒸餾水沖洗1 min×3次，0.1%Triton+TBS浸泡5 min。10%FBS+TBS室溫孵育20－30 min。加1∶1000 NTF2Ⅰ抗(BD)4℃濕盒過夜。Ⅱ抗+Hoechst 33342孵育 37℃ 30 min。TBS 10 min×2次，水溶性封片劑封片觀察。以上實驗重復(fù)3次。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示，采用單因素方差分析(ANOVA)的Dunnett’t檢驗比較正常對照組和各糖尿病組之間的差異，各糖尿病組之間的比較采用SNK－q檢驗進行分析。

結(jié) 果

1 糖尿病大鼠和對照組鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)

EB注射后視網(wǎng)膜鋪片EB呈紅色熒光，均勻地充盈于血管腔，使視網(wǎng)膜各級血管網(wǎng)絡(luò)包括毛細血管網(wǎng)能夠清晰地顯示。正常組大鼠可見在低背景熒光下視網(wǎng)膜血管對EB有很好的屏障作用，見圖1A;成模2周后糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)未見明顯改變，僅見背景熒光增強，見圖1B;成模1月后血管出現(xiàn)異常節(jié)段性擴張，局部血管周圍 EB滲漏，見圖1C。成模3月后可見視網(wǎng)膜毛細血管EB滲漏增多，背景熒光增強，見圖1D。

Figure1.Flat－mounted，EB －perfused retina from diabitc and normal rats.A:normal retina.Dye was contained in retinal vessels without leakage(×100);B:two weeks after diabetes(D2w)retina，the increasing background fluorescence(×100);C:one month after diabetes(D1m)retina，arrows indicate regional leakages from capillary(×100);D:three months after diabetes(D3m)retina，arrows show the increasing leakages of dye from periphery capillary(×100).圖1 正常和糖尿病大鼠視網(wǎng)膜EB灌注鋪片熒光顯微鏡照片

2 NTF2和VEGF mRNA在視網(wǎng)膜中的表達變化

RT－PCR結(jié)果顯示:各組內(nèi)參照β－actin的表達量較均衡。計算2組各時點NTF2和VEGF與β－actin的比值并進行比較。不同鼠齡正常大鼠造模前至6月中各時點NTF2與VEGF的表達量相似，無明顯改變，P＞0.05，見圖2。故而選用2周正常大鼠視網(wǎng)膜組織為對照組(N)，糖尿病2周、1月、3月和6月視網(wǎng)膜組織為實驗組。糖尿病組大鼠成模2周后(D2w)，VEGF mRNA表達量開始增加，1月后漸達高峰，為正常鼠的1.78倍，P＜0.01;3月時VEGF下降，但仍然高于正常，P＜0.01;到糖尿病6月時，VEGF又顯著升高，為正常的1.99倍。正常鼠視網(wǎng)膜NTF2表達水平相對穩(wěn)定，不隨年齡的增長而變化，病理情況下(糖尿病成模后2周)輕度上升，為正常鼠的1.24倍，P＜0.01，并不隨病程的延長而有明顯變化，P＞0.05。但到糖尿病6個月時，NTF2表達開始回落，與正常大鼠基本一致，P＞0.05，見圖3。

3 NTF2在糖尿病組和對照組大鼠視網(wǎng)膜切片中的免疫組化結(jié)果

在對照組大鼠的視網(wǎng)膜切片中，可見NTF2陽性染色主要位于節(jié)細胞的胞漿及內(nèi)核層中，表現(xiàn)為較強紅色熒光，見圖3A。節(jié)細胞層的小血管壁上也可見陽性染色，見圖3B。糖尿病組中，NTF2表達及分布與正常組基本一致，無明顯變化，見圖3C。

Figure3.NTF2 and VEGF mRNA expression in diabetic rats.A:RT－PCR analysis.B:RT－PCR quantization showed the expression of NTF2 and VEGF mRNA in normal(N)and diabetic(D)rats.Figure 3B showed an increase in NTF2 level in D2w..n=6.＊＊P＜0.01，##P＜0.01 vs N group.N:control rat retina;D2w:retina from rats of two weeks after diabetes;D1m:retina from rats of one month after diabetes;D3m:retina from rats of three months after diabetes;D6m:retina from rats of six months after diabetes.圖3 糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中NTF2和VEGF mRNA的表達

Figure4.Confocal immunohistochemistry image of NTF2 expression.A:normal rat retina stained with anti－NTF2，NTF2 located in inner layers of retina，including NFL and OPL.NTF2 also located in INL except NFL and OSL.B:vessel wall stained with anti－NTF2 antibodies in NFL(red:NTF2;blue:showed the location of INL and ONL)(NFL:nerve fiber layer;OPL:outer plexiform layer;INL:inner nuclear layer;ONL:outer nuclear layer).C:NTF2 cells located in dibietic rats retina.NTF2 positive cells showed no difference between normal rats retina and diabetic rats retina.圖4 正常大鼠和糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中NTF2熒光免疫組化

討 論

1 NTF2與眼及DR的關(guān)系

細胞核是真核細胞內(nèi)最重要的細胞器。真核細胞胞內(nèi)部分被核膜分為核區(qū)與質(zhì)區(qū)，核區(qū)與質(zhì)區(qū)之間存在連續(xù)而有選擇性雙向物質(zhì)交換(核轉(zhuǎn)運)。核膜孔復(fù)合體(nuclear pore complex，NPC)蛋白參與所有大分子物質(zhì)的主動及被動核轉(zhuǎn)運過程。NTF2作為一種重要的NPC相關(guān)蛋白，主要通過NPC幫助GDP－Ran進入到細胞核，維持跨膜間GDP－Ran梯度，這個跨膜梯度決定了mRNA、tRNA、轉(zhuǎn)錄因子等大分子轉(zhuǎn)運的方向，對Ran的功能起重要的支持作用。目前對NTF2的研究局限于其蛋白質(zhì)分子構(gòu)象方面[3]。有關(guān)NPC與人類疾病，如自身免疫性疾病、腫瘤、病毒感染以及遺傳性疾病的關(guān)系日益受到人們的關(guān)注[4]。Bhattacharya 等[1]人發(fā)現(xiàn)，NTF2 表達下降會導(dǎo)致果蠅復(fù)眼數(shù)目的大量減少，并且果蠅蟲卵的免疫系統(tǒng)遭到嚴重打擊，這提示NTF2基因在眼部和免疫系統(tǒng)發(fā)育中可能起重要的調(diào)控作用。另外，NTF2在正常大鼠免疫熒光顯示陽性細胞主要位于節(jié)細胞及節(jié)細胞層的血管壁中，Sheffield等[5]在5名老年癡呆癥患者的額葉腦組織活檢的切片免疫組化實驗中發(fā)現(xiàn)NTF2在神經(jīng)元核周圍的異常聚集，提示NTF2在老年癡呆癥發(fā)病中可能起到一定的作用，這更進一步表明NTF2與神經(jīng)組織及血管組織關(guān)系的密切性。DR是以微血管病變?yōu)橹鞯难鄄坎l(fā)癥，并伴有后期視網(wǎng)膜神經(jīng)組織的凋亡，因此，對NTF2基因進行深入研究，有望為糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生機制和治療提供新的切入點和新的思路。

DR是糖尿病最常見的并發(fā)癥，目前DR遺傳學(xué)研究主要集中于DR易感基因的研究，臨床觀察表明:糖尿病患者并發(fā)DR具有明顯的差異性，有些患者較早發(fā)生DR(易感性)，有些則長期不發(fā)病(非易感性)。針對這一現(xiàn)象，我們根據(jù)Collins提出尋找“genetic factors in maintaining good health”[6]健康基因的新思路，為DR的治療尋找新的靶點，為DR的發(fā)生發(fā)展探索新的研究途徑。選擇20年以上病程的2型糖尿病患者，以是否發(fā)生糖尿病視網(wǎng)膜病變分為眼底正常組(normal組，N組)和PDR組(P組)，利用基因芯片技術(shù)對比分析2組的基因表達，并進行差異基因表達譜分析及蛋白功能分析?；蛐酒Y(jié)果發(fā)現(xiàn)NTF2基因在眼底正常組顯著性高表達[7]，推測這一在眼底正常組高表達的基因具有保護糖尿病患者眼底血管功能的作用，所以我們將其作為進一步研究的對象。

2 NTF2及VEGF在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達

DR是以新生血管形成為主要標志的微血管病變，VEGF是迄今為止發(fā)現(xiàn)的作用最強、特異性最高、最直接的血管新生誘導(dǎo)因子，因此，VEGF在DR的發(fā)生發(fā)展中起很關(guān)鍵的作用[8]，也是DR動物模型觀測的重要指標之一。本研究中，我們采用目前最常用的腹腔注射STZ誘導(dǎo)大鼠糖尿病的經(jīng)典DR模型，同時也觀察了VEGF在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的變化。在糖尿病2周后開始升高，到1月時達到高峰，3月時開始下降，但仍然高于正常，這一結(jié)果與眾多研究一致[9，10]，EB灌注后視網(wǎng)膜鋪片的染料滲漏也證明糖尿病早期即可出現(xiàn)視網(wǎng)膜血管屏障功能的破壞，進一步證實了本研究中STZ誘導(dǎo)大鼠糖尿病的DR模型的成功建立。在此基礎(chǔ)上，我們觀察NTF2在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的動態(tài)表達，以期初步揭示NTF2與糖尿病視網(wǎng)膜病變的關(guān)系。

我們的初步研究結(jié)果顯示:大鼠正常生長過程中，視網(wǎng)膜NTF2在mRNA水平表達較高且穩(wěn)定，與內(nèi)參照β－actin表達相當，這與其在核轉(zhuǎn)運中的作用密不可分，因而，NTF2是一相對保守的上游基因。在病理狀態(tài)下，糖尿病早期，視網(wǎng)膜中NTF2的改變與VEGF具有同步性，兩者在mRNA水平均在糖尿病成模后2周后均開始升高，此后隨著病程的延長，二者mRNA水平變化各不相同，VEGF表達到1月時達到高峰，3月時開始下降，但仍然高于正常，6個月VEGF又開始升高;NTF2在糖尿病2周后，表達輕度升高，但并未隨病程的延長進一步升高，而是表現(xiàn)出在輕度升高后的穩(wěn)態(tài)，這或許是糖尿病初期機體的保護性應(yīng)激反應(yīng)，因NTF2基因相對保守未能出現(xiàn)明顯的增減。隨糖尿病病程延長，6個月時NTF2表達有所回落，但仍維持較高水平，與VEGF變化呈相反趨勢，提示病變不同時期，二者在糖尿病視網(wǎng)膜病變中所起的作用不同。早期和晚期NTF2的不同表達模式，很可能是維持代謝紊亂條件下神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及視網(wǎng)膜屏障功能完整的重要適應(yīng)機制。此實驗中我們還觀察到，在糖尿病1月和3月時，NTF2表達還較多出現(xiàn)在視網(wǎng)膜內(nèi)核細胞層，與文獻報道的VEGF蛋白表達位置一致[10]。由以上結(jié)果我們推論，NTF2很可能在糖尿病視網(wǎng)膜病變中起著一定的調(diào)控作用，其作用途徑及機理可能與VEGF的作用通路可能有一定的聯(lián)系。當然NTF2具體的作用機制和通路有待進一步研究。這也正是本課題組目前正在進行的工作。

[1]Bhattacharya AR，Steward R.The Drosophila homolog of NTF－2，the nuclear transport factor－2，is essential for immune response[J].EMBO Rep，2002，3(4):378 －383.

[2]史 煜，李 斌，李 濤，等.rAAV2－NTF2對糖尿病大鼠血視網(wǎng)膜屏障的保護作用[J].中國病理生理雜志，2009，25(4);759－763.

[3]Stewart M.Insights into the molecular mechanism of nuclear trafficking using nuclear transport factor 2(NTF2)[J].Cell Struct Funct，2000，25(4);217 －225.

[4]Cronshaw JM，Matunis MJ.The nuclear pore complex:disease associationsand functionalcorrelations[J].Trends Endocrinol Metab，2004，15(1);34－39.

[5]Sheffield LG，Miskiewicz HB，Tannenbaum LB.Nuclear pore complex proteins in Alzheimer disease[J].J Neuropathol Exp Neurol，2006，65(1);45 －54.

[6]Collins FS，Green ED，Guttmacher AE.A vision for the future of genomics research[J].Nature，2003，422(6934);835－847.

[7]Li B，Zhang HQ，Shi Y，et al.Overexpression of nuclear transport factor 2 may protect against diabetic retinopathy[J].Mol Vis，2009，15(7);861 －869.

[8]周浩川，張惠蓉.增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者玻璃體中血管內(nèi)皮細胞生長因子含量的檢測[J].中華眼科雜志，1997，33(4);247－250.

[9]Schratzberger P，Walter DH，Rittig K.Reversal of experimental diabetic neuropathy by VEGF gene transfer[J].J Clin Invest，2001，107(9);1083 －1092.

[10]Poulaki V，Joussen AM，Mitsiades N.Insulin－like growth factor－I plays a pathogenetic role in diabetic retinopathy[J].Am J Pathol，2004，165(2);457 －469.