妊娠期高血壓患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞的變化及意義*

曹衛平， 錢秋菊， 溫 堅， 陳 霽， 汪科換， 邵春梅

(1鎮江市婦幼保健院，江蘇鎮江212001;2鎮江市潤州區人民醫院，江蘇鎮江212000)

妊娠期高血壓疾病是妊娠期特有的疾病，嚴重威脅母嬰安全，是孕婦和圍產兒發病和死亡主要原因之一。其發病率高達7%－10%，但確切原因和發病機制至今尚不十分清楚。現代生殖免疫學研究證明，正常妊娠的維持有賴于母胎免疫耐受的形成，一旦免疫耐受機制失衡，將導致病理性妊娠如流產、妊娠期高血壓疾病等發生。近年來研究發現CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞在外周免疫耐受、移植免疫耐受以及母體對胎兒的耐受方面起著重要作用［1］。轉錄因子Forkhead box p3、Foxp3是CD4+CD25+Treg細胞發育和功能維持的重要調節基因［2］。本研究采用流式細胞術胞內染色和定量PCR的方法，分別從蛋白質和 mRNA水平檢測Foxp3+的表達，以探討CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞在妊娠期高血壓疾病發病中作用。

材料和方法

1 材料

1．1 主要試劑 異硫氰酸酯(flioresceine isothiocyanate，FITC)熒光標記抗人CD4、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標記的抗人CD25以及藻紅蛋白－青色素染料5(phycoerythrincyanine Dye5，PE－Cy5)標記的抗人Foxp3試劑盒(含配套的固定和透膜劑)均購自eBioscience;淋巴細胞分離液(上海試劑二廠)，RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen);逆轉錄及定量PCR試劑盒(TaKaRa)。

1．2 研究對象及分組 選擇2007年11月至2008年6月在鎮江市婦幼保健院、鎮江市潤州區人民醫院門診及住院的56例妊娠期高血壓疾病患者。其中妊娠期高血壓疾病20例，輕度子癇前期16例、重度子癇前期20例。年齡平均為(30.2±4.8)歲，孕周平均為(35.6±3.2)周;選擇同期正常孕婦20例，年齡平均為(31.4±5.2)歲，孕周平均為(37.2±1.4)周。正常育齡婦女16例，年齡平均為(29.2±5.8)歲。年齡比較差異無顯著。2組孕婦孕周比較無顯著差異。妊娠期高血壓疾病的診斷參考樂杰主編的《婦產科學》(第6版)中的標準。

2 方法

2．1 標本采集 各組研究對象抽取靜脈血4 mL，乙二胺四乙酸二鈉(ethylene diamine tetraucetie acid disodium salt，Na2EDTA)抗凝，采用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，以PBS洗滌后重懸備用。

2．2 細胞表面及胞內染色以及檢測 細胞染色的順序是先進行細胞表面分子CD4及CD25的染色，然后經過固定、透膜后再染細胞內的Foxp3的分子。簡要概括如下:取細胞懸液100μL，加20μL CD4FITC和CD25－PE混合抗體，避光4℃孵育30 min，冷PBS洗滌后再加入1 mL經過稀釋的固定、透膜劑反應60 min后以透膜緩沖液洗滌并重懸，再加入20μL PE－Cy5標記的抗人Foxp3抗體(同時設同型對照反應管)，反應30 min后洗滌，以400μL冷PBS重懸，采用BDFACSCalibur流式細胞儀進行檢測，應用CellQuest軟件進行結果分析。

2．3 總RNA抽提及逆轉錄反應 采用Trizo1試劑提取外周血單個核細胞總RNA，取總RNA 2μg進行逆轉錄反應合成cDNA。

2．4 定量PCR檢測Foxp3mRNA表達 取上述cDNA，采用TaKaRa公司SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進行PCR反應，總體積為20μL，按試劑說明書操作。引物由上海生工合成，Foxp3:5’－TTTCTGTCAGTCCACTTCACCA －3’和 5’－CCAGCAGGTCTGAGGCTTTG－3’;β－actin:5’－TGGCACCCAGCACAATGAA－3’和 5’－TAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA－3’。Foxp3的表達水平以其與內參照β－actin的比值表示，所用定量PCR儀型號為羅氏Lightcycler。

3 統計學處理

應用Stata 7.0軟件進行統計學分析，數據以均數±標準差(ˉx±s)表示，組間均數比較采用t檢驗和方差分析。

結 果

1 流式細胞術檢測妊娠期高血壓疾病患者外周血CD4+CD25+T細胞比例改變

應用流式細胞術雙標記技術檢測妊娠期高血壓疾病患者外周血CD4+T細胞CD25分子的表達，結果發現，與正常育齡婦女相比，正常妊娠婦女外周血中CD4+CD25+T細胞所占比例明顯增加(P＜0.05)，妊娠期高血壓患者呈下降趨勢，但差異無顯著(P＞0.05)，而子癇前期患者明顯減少(P＜0.01);與正常妊娠婦女比較，妊娠期高血壓組CD4+CD25+T細胞所占比例有減少的趨勢，但差異無顯著(P＞0.05)，子癇前期(包括輕度與重度)CD4+CD25+T細胞所占比例明顯減少(P＜0.01)，而且重度子癇前期的比例明顯低于妊娠高血壓患者(P＜0.05)，見表1。

表1 流式細胞術檢測妊娠期高血壓疾病患者外周血CD4+CD25+T細胞Table 1．Detection of CD4+CD25+T cells in peripheral blood of patients with gestational hypertension by flow cytometry(%．ˉx±s)

2 流式細胞術檢測妊娠期高血壓疾病患者外周血CD4+CD25+Foxp3比例變化

與正常育齡婦女相比，正常妊娠婦女外周血中CD4+CD25+Foxp3調節性T細胞所占比例明顯增加(P＜0.05)，而妊娠期高血壓、輕度子癇前期和重度子癇前期患者CD4+CD25+Foxp3調節性T細胞所占比例明顯低于正常育齡(P＜0.05)和正常妊娠婦女(P＜0.01)。另外，輕度子癇前期和重度子癇前期患者CD4+CD25+Foxp3調節性T細胞所占比例明顯低于妊娠期高血壓(P＜0.05)，見圖1。

3 定量PCR檢測妊娠期高血壓疾病患者外周血Foxp3 mRNA表達

為進一步驗證流式細胞術檢測調節性T細胞的結果，采用定量PCR的方法檢測了Foxp3 mRNA表達水平，所得結果與蛋白質表達水平相一致，見圖2。

討 論

近年來，一些具有免疫調節功能的T細胞(Treg)引起了研究者的廣泛關注。胸腺來源的CD4+CD25+調節性T細胞(Treg)，約占人外周血CD4+T細胞的5% －10%，是最重要的Treg細胞亞群之一，其主要的功能有維持內環境穩定、抑制機體對同種異體移植物的排斥反應以及影響其它T細胞的功能等。CD4+CD25+Treg對人類妊娠有著重要的影響［1］。研究發現妊娠早期直至分娩后短暫時期，循環系統中Treg細胞顯著增加。體外研究發現CD4+CD25+T細胞對母體自身有抑制效應。本研究發現，正常妊娠婦女外周血中CD4+CD25+T細胞所占比例明顯增加，妊娠期高血壓組CD4+CD25+T細胞所占比例有減少的趨勢，但無顯著差異，而子癇前期(包括輕度與重度)CD4+CD25+T細胞所占比例明顯減少。Sasaki等［3］也報道子癇前期患者外周血中CD4+CD25+T細胞明顯低于正常妊娠和正常育齡婦女，該結果與本研究結果相一致，提示這群調節性細胞可能參與了妊娠期高血壓疾病發病。

Foxp3是一種轉錄因子，定位于細胞內，是CD4+CD25+T細胞分化發育和功能維持的一個重要調控基因。目前已證實Foxp3的mRNA及其編碼蛋白Scurfin只特異性地表達于CD4+CD25+T細胞。雖然大部分CD4+CD25+T細胞產生于胸腺，但胸腺內Foxp3過度表達卻不能阻止缺失功能性Foxp3基因小鼠疾病的發生，說明Foxp3在外周CD4+T細胞具有重要的功能。本研究發現Foxp3水平在各組間變化一致，即CD4+CD25+Foxp3調節性T細胞在正常妊娠時顯著增加，而妊娠期高血壓疾病患者，隨著疾病進展，CD4+CD25+Foxp3調節性T細胞，逐漸下降，至重度子癇前期，下降尤為顯著［4］，同時定量PCR檢測結果也證明與蛋白質結果相一致，這些結果表明調節性T細胞可能參與了妊娠期高血壓疾病的病理進程。外周血CD4+T細胞Foxp3表達降低，說明真正發揮抑制功能的調節性T細胞數量降低。而調節性T細胞的減少可能使妊娠期高血壓疾病患者機體內負向調控機制發生紊亂，產生針對自身抗原成分的效應細胞及分子，打破了機體內環境穩定，從而引起母體免疫損傷，使胚胎易遭受免疫攻擊而被母體排斥。

Figure 1．Flow cytometric analysis of the expression of the transcription factor Foxp3．A:the proportion of Foxp3．ˉx±s．n=36(n=16 mild preeclampsia;n=20 severe preeclampsia)．*P＜0.05 vs normal pregnancy group;#P＜0.05 vs non－pregnancy group;◆P＜0.05 vs hypertensive disorder complicating pregnancy(HDCP)group．B:plots for Foxp3 vs CD25 expression of gated CD4+T cells，the Foxp3 positive cells were quantitated for the CD25+populations．PE:preeclampsia．圖1 流式細胞術檢測妊娠期高血壓疾病患者CD4+CD25+Foxp3+比例變化

Figure 2．Analysis of Foxp3 expressing level in gestational hypertension patients of peripheral blood by using realtime PCR．ˉx±s．n=36(n=16 mild preeclampsia;n=20 severe preeclampsia)．*P ＜ 0.05 vs normal pregnancy group;#P＜0.05 vs non－pregnancy group;◆P＜0.05 vs hypertensive disorder complicating pregnancy(HDCP)group．PE:preeclampsia．圖2 定量PCR檢測妊娠期高血壓疾病患者外周血Foxp3mRNA表達

本研究從蛋白質和mRNA水平證明了CD4+CD25+Foxp3調節性T細胞在妊娠期高血壓疾病進程中表達異常，進一步深入研究CD4+CD25+Foxp3在妊娠期高血壓疾病中作用，有望從蛋白質和mRNA水平找到新的干預靶點，從而通過使用主動免疫治療為妊娠期高血壓疾病的診治提供新途徑。

［1］ 陳莉娟，周 浩，朱劍文，等．Foxp3轉染CD4+CD25－T細胞抑制 NK細胞活性［J］．中國病理生理雜志，2009，25(6):1151－1155．

［2］ Zheng Y，Rudensky AY．Foxp3 in control of regulatory T cell lineage［J］．Nat Immunol，2007，8(5):457 －462．

［3］ Sasaki Y，Darmochwakl－Kolarz D，Suzuki D，et al．Proportion of peripheral blood and decidual CD4+CD25+regulatory T cells in pre － eclampsis［J］．Clin Exp Immunol，2007，149(1):139－145．

［4］ Wilczvnski JR．Immunological analogy between allograft rejection，recurrent abortion and preeclampsia the same basic mechanism? ［J］．Hun Immunol，2006，67(7):492－511．