高血壓病和2型糖尿病患者血清損傷ECV－304細胞的比較研究*

周永紅， 陳利國△， 屈 援， 唐海蘭， 程少冰

(暨南大學1醫學院中醫系，2管理學院，3實驗技術中心，廣東 廣州 510632)

中醫研究發現，高血壓病和2型糖尿病中均表現出血瘀證［1－4］的證候，說明在臨床上存在“異病同證”，但其病理生理基礎尚需進一步研究。體外培養的人臍靜脈內皮細胞和體內重要器官血管內皮的功能有相似性［5］，本研究在前期建立2型糖尿病血瘀證血管內皮細胞損傷模型的基礎上［3］，進一步觀察高血壓病和2型糖尿病血瘀證患者血清損傷ECV－304細胞后造成的細胞形態、細胞活性、細胞內分泌功能、細胞內游離鈣濃度和骨架微絲分布的變化，對比不同疾病的血瘀證細胞損傷模型的差異，以探討中醫“異病同證”的病理生理學基礎，為血瘀證的證候實質研究提供相關依據。

材料和方法

1 材料

1.1 細胞來源 ECV－304細胞購于武漢大學中國典型培養物保藏中心。

1.2 病人資料 (1)2型糖尿病血瘀證組:選取2005年9月－2006年8月暨南大學附屬第一醫院內分泌科、中醫科和神經內科住院的患者40例，符合WHO1999年［6］和 ADA2003年“2型糖尿病”診斷標準［7］和1986年修訂的血瘀證診斷標準［8］。平均年齡(68.4±7.3)歲。(2)高血壓病血瘀證組:為同期暨南大學附屬第一醫院心血管科、中醫科和神經內科就診及健康體檢的老年新近診斷為高血壓病(1－2級)且未使用降壓藥物的病例的患者40例，診斷標準按照美國JNC7指南的診斷標準(收縮壓≥140 mmHg且舒張壓 ＜ 90 mmHg)［9］和血瘀證診斷標準［8］。其中，按血壓級別分為:1級高血壓患者8例，2級高血壓患者32例，平均年齡(70.7±4.1)歲。所選病例能較好地代表血瘀證的各種兼證的臨床分布情況。2組患者均排除心、腦、腎等并發癥，2組患者的性別分布和平均年齡無顯著差異(P＞0.05)，具有可比性。

1.3 血清制備收集 空腹取血，自凝后4℃、2000 r/min離心15 min，取上清液置無菌EP管中，56℃滅活30 min，－20℃凍存，備用。

1.4 試劑 胰蛋白酶、噻唑藍(thiazolyl blue，MTT)和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自Sigma。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所。DMEM培養基、Triton X－100和牛血清白蛋白(BSA)購自Gibco。內皮素(endothelin，ET)放免試劑盒購自北京普爾偉業生物科技有限公司。一氧化氮(nitric oxide，NO)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。內皮細胞蛋白C受體(endothelial cell protein C，EPCR)、血管性假性血友病因子(von Willabrand factor，vWF)和血栓調節蛋白(thrombomodulin，sTM)酶聯免疫定量檢測(ELISA)試劑盒均購自ADL。Fluo－3/AM購自Bio－Rad。羅丹明標記的鬼筆環肽(Rhodamine phalloidin)購自 Invitiogen(300 U，貨號 R415)。Hoechst 33258購自華美生物工程公司。Phtri皿為Corning。激光共聚焦顯微鏡為Carl Zeiss。

2 方法

2.1 MTT法觀察細胞活性［10］將內皮細胞以5×107cells/L的濃度種入96孔培養板，進行分組干預。糖尿病血瘀證組加入10%濃度的糖尿病血瘀證患者血清，高血壓病血瘀證組加入10%濃度的高血壓病血瘀證患者血清，對照組則加入等量的DMEM。繼續培養24 h。終止干預后予PBS洗去培液，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，孵育4 h，傾去上清液，加 DMSO 150 μL，振蕩10 min，使藍紫色結晶充分溶解。全自動酶標儀于570 nm處測定吸光度值。

2.2 光鏡和電鏡下細胞形態學觀察 按照1×108cells/L的密度接種于6孔培養板，每孔2 mL細胞懸液。用含10%FBS的DMEM培養24 h后，觀察大部分細胞相互融合形成單層，細胞呈現卵石狀排列，棄培養液，換無血清培養液進行饑餓，24 h后換新培養液，血清干預方法同前。繼續培養24 h。倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。

按照2×107cells/L的密度將細胞種植在6孔培養板中的蓋玻片上，干預方案同前，經過固定、洗滌、脫水、加乙酸異戊酯和CO2臨界點干燥等程序后，掃描電鏡下觀察和拍片。

按照1×108cells/L的密度將細胞接種在25 mL培養瓶中，干預方案同前，經過固定、漂洗、梯度脫水、滲透和包埋、固化、超薄切片和染色等程序后，透射電鏡下觀察和拍片。

2.3 各組血清對細胞內分泌功能的影響 NO檢測利用硝酸還原酶法，ET檢測利用非平衡法，EPCR檢測、vWF檢測和sTM檢測均采用ELISA法，于波長450 nm的酶標儀上讀取各孔的A值，以A值為自變量(Y)，以標準品的濃度為因變量(X)，通過曲線擬合的方法求出標準曲線方程。

2.4 共聚焦顯微鏡下觀察細胞內游離鈣濃度 按照1×108cells/L將細胞種植在Petri皿中，干預方法同前;終止干預后予PBS沖洗2次，10 μmol/L Fluo－3/AM加于Petri皿，37℃培養箱中培養30 min;取出Petri皿，用PBS沖洗后置于激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。Fluo－3/AM的激發波長為488 nm，發射波長為525 nm，Kd值(熒光劑與Ca2+形成配合物的解離常數)在(0.37－2.30)×10－6之間。以上實驗均重復6次。

2.5 熒光探針標記的鬼筆環肽染色法觀察細胞骨架微絲 按照1×108cells/L將細胞種植在6孔培養板的蓋玻片上，干預方法同前;終止干預后37℃的PBS清洗細胞2次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗2次后滴加0.1%Triton X－100放置5 min，PBS清洗后用5%BSA孵育細胞30 min，加入熒光探針標記的鬼筆環肽染色，避光室溫放置2 h，PBS清洗細胞后滴加1%Hoechst，避光室溫放置10 min，PBS清洗細胞后緩沖甘油封片，－20℃冰箱凍存。激光共聚焦顯微鏡下觀察。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件分析，計量資料數據以均數±標準差()表示。多組間比較采用單因素方差分析。

結 果

1 血清損傷后細胞活性變化結果

MTT結果顯示:10%血清作用下，高血壓病血瘀證組的細胞活力低于對照組(P＜0.05)，糖尿病血瘀證組的細胞活力也低于對照組(P＜0.05)，但高血壓病血瘀證組的細胞活力與糖尿病血瘀證組無顯著差異(P＞0.05)。

表1 各組血清對細胞活性的影響Table 1.Effect of the sera of patients with hypertension and type 2 diabetes mellitus on viability of ECV－304 cells(.n=8)

表1 各組血清對細胞活性的影響Table 1.Effect of the sera of patients with hypertension and type 2 diabetes mellitus on viability of ECV－304 cells(.n=8)

*P ＜0.05 vs control.

Control 1.51 ±0.16 sera from patients with T2DM 0.88 ±0.11*sera from patients with hypertension 0.98 ±0.12*

2 血清損傷后細胞形態觀察

倒置相差顯微鏡下觀察空白對照組細胞呈現典型血管內皮細胞形態;糖尿病血瘀證組中細胞間隙增寬，部分輪廓不清，碎片較多;高血壓病血瘀證組形態與糖尿病血瘀證組類似，見圖1。

Figure 1.Morphology of ECV －304 cells under inverted phase contrast microscope(×200).A:control;B:sera from patients with T2DM;C:sera from patients with hypertension.圖1 倒置相差顯微鏡下各組細胞的形態

掃描電鏡下觀察空白對照組細胞呈現橢圓形，細胞表面有絲狀突起;糖尿病血瘀證組細胞明顯變形，有的收縮分離成為放射星狀體，表面有大小不一的圓形凹陷或突起;高血壓病血瘀證組細胞變形，有的細胞之間有指狀突起相連接，表面有大小不一的圓形凹陷或突起，見圖2。

Figure 2.Morphology of ECV －304 cells under scanning electron microscope(×5000).A:control;B:sera from patients with T2DM;C:sera from patients with hypertension.圖2 掃描電鏡下各組細胞的表面結構

透射電鏡觀察空白對照組細胞表面微絨毛豐富，粗面內質網、核糖體、平面內質網、線粒體雙層膜及內嵴結構清晰，核形態為圓形，見核仁;糖尿病血瘀證組細胞表面有少量微絨毛，胞漿內吞飲泡較多，大小不一。粗面內質網較少并擴張，核糖體部分丟失。平面內質網擴張呈現空泡狀，線粒體模糊不清，嵴消失，核未見特殊改變;高血壓病血瘀證組細胞形態與糖尿病血瘀證組類似，見圖3。

Figure 3.Morphology of ECV－304 cells under transmission electron microscope.A:control(×30000);B:sera from patients with T2DM(×24000);C:sera from patients with hypertension(×15000).圖3 透射電鏡下細胞的超微結構觀察

3 血清損傷后細胞內分泌功能變化

高血壓病血瘀證組的ET水平高于對照組(P＜0.05)，糖尿病血瘀證組也高于對照組(P﹤0.05)，且高血壓病血瘀證組的ET水平低于糖尿病血瘀證組(P＜0.05);高血壓病血瘀證組的NO水平低于對照組(P＜0.05)，糖尿病血瘀證組也低于對照組(P＜0.05)，且高血壓病血瘀證組的NO水平高于糖尿病血瘀證組(P＜0.05)，高血壓病血瘀證組的EPCR、vWF和sTM含量高于對照組(P＜0.05)，糖尿病血瘀證組也高于對照組(P＜0.05)，且高血壓病血瘀證組的EPCR水平低于糖尿病血瘀證組(P＜0.05)，而高血壓病血瘀證組的vWF和sTM含量與糖尿病血瘀證組之間無顯著差異(P＞0.05)。以上均見表2。

表2 各組細胞內分泌功能變化Table 2.Changes of ET，NO，EPCR，vWF and sTM expression in ECV－304 cells incubated with the sera of patients with hypertension and T2DM(.n=8)

表2 各組細胞內分泌功能變化Table 2.Changes of ET，NO，EPCR，vWF and sTM expression in ECV－304 cells incubated with the sera of patients with hypertension and T2DM(.n=8)

*P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs sera from patients with T2DM.T2DM:type 2 diabetes mellitus.

Group ET(nmol/L) NO(μmol/L) EPCR(mg/L) vWF(%) sTM(μmol/L)Control 77.88 ±10.07 52.97 ±8.51 113.94 ±16.04 51.09 ±9.92 18.47 ±2.59 Sera from patients with T2DM 286.03 ±24.03* 22.37 ±3.30* 189.66 ±11.76* 79.94 ±8.52* 29.25 ±5.16*Sera from patients with hypertension 177.62 ±15.77*# 32.61 ±6.76*#168.32 ±21.94*#80.17 ±10.25* 28.36 ±4.94*

4 血清損傷后對胞內游離鈣濃度的影響

高血壓病血瘀證組［Ca2+］i高于對照組(P＜0.05)，糖尿病血瘀證組［Ca2+］i高于對照組(P＜0.05)，見表3。高血壓病血瘀證組［Ca2+］i高于糖尿病血瘀證組(P＜0.05);表現在胞漿中的熒光分布不均勻，呈網狀或團塊狀，見圖4。

Figure 4.Changes in［Ca2+］iof ECV －304 cells under laser scanning confocal microscope(×600).A:control;B:sera from patients with T2DM;C:sera from patients with hypertension.圖4 激光共聚焦顯微鏡下各組細胞的［Ca2+］i熒光圖像

表3 各組細胞內游離鈣濃度比較Table 3.Changes of intracellular free calcium concentration(［Ca2+］i)in ECV－304 cells incubated with the sera of patients with BSS associated with hypertension and T2DM(.n=48)

表3 各組細胞內游離鈣濃度比較Table 3.Changes of intracellular free calcium concentration(［Ca2+］i)in ECV－304 cells incubated with the sera of patients with BSS associated with hypertension and T2DM(.n=48)

＊P＜0.05 vs sera from patients with T2DM.

Group ［Ca2+］i(fluorescence intensity)Control 92.05 ±6.42 Sera from patients with T2DM 127.53 ±10.48*Sera from patients with hypertension 156.78 ±8.22*

5 血清損傷后對細胞骨架微絲的影響

對照組細胞骨架微絲分布規則，彼此連接，附著在細胞內特定部位，呈絲網狀有序排列;糖尿病血瘀證組可見細胞外形皺縮，間隙加大，微絲斷裂，排列紊亂，少部分區域缺失，微絲收縮變短或移向周邊，絲網狀有序排列消失;高血壓病血瘀證組可見細胞間隙加大，微絲全部斷裂，排列紊亂，大部分微絲收縮成團，少部分微絲缺失出現空隙，見圖5。

Figure 5.Cytoskeleton of ECV－304 cells under laser scanning confocal microscope(×400).A:control;B:sera from patients with T2DM;C:sera from patients with hypertension.圖5 激光共聚焦顯微鏡下各組細胞的骨架微絲分布

討 論

證候模型是中醫藥實驗研究的重要工具，利用證候模型來研究中醫基礎理論及臨床療效，可以為中醫學的研究和發展提供科學依據［11］。我們在前期建立糖尿病血瘀證血管內皮細胞損傷模型的基礎上［3］，針對高血壓病血瘀證血管內皮細胞損傷模型和糖尿病血瘀證血管內皮細胞損傷模型進行比較研究，以明確在特定環境下細胞內部發生的共同變化機制。因此我們應用前期較為成熟的技術如血管損傷標志物、胞內游離鈣濃度和細胞骨架微絲來揭示異病同證的共性，尋找出血瘀證中某些具有普遍意義的最基本的客觀指標，為病證結合細胞模型的深入研究提供實驗和理論基礎。

實驗中我們觀察到高血壓病血管內皮細胞損傷模型和2型糖尿病血瘀證血管內皮細胞損傷模型都存在不同程度的內皮功能障礙，與人體中內皮細胞所處的解剖部位是一個易損傷的功能性界面有關，各種損傷刺激和心血管危險因素都首先作用于此，導致功能的降低和紊亂［12］。正是由于出現內皮功能障礙的作用機制有相同之處，表現在細胞形態和細胞活性、細胞內分泌功能(vWF和TM)等方面沒有明顯的差異，此為“證”同，可以作為“血瘀證”共同的病理生理學基礎模型。而在異“病”方面，由于糖尿病和高血壓病的發病機制不同，臨床表現各異，尤其高血壓病涉及到血脂異常，服用藥物等因素，所以二者的血清也在不同程度上存在差異，因而造成血管內皮細胞損傷的程度也不同，例如細胞內分泌功能(EPCR、ET和NO)、細胞內鈣離子的濃度等，此一點有可能作為“病”異的基礎，前后結合后則明確體現了異“病”同“證”的特點，深入機制探討將有可能對血瘀證的微觀辨證提供依據。

另外，我們在以往的研究曾經討論過，細胞內鈣離子的升高可能介導了血瘀證血清對細胞骨架的損傷作用［13］。此次的研究中也證實了這點，細胞內鈣離子濃度高的高血壓病血瘀證組在細胞骨架微絲的分布上與空白對照組差異最大，此一點也可以解釋“異病同證”的血管內皮細胞損傷模型在細胞骨架微絲上的差異。

［1］韓學杰，朱 妍，陳 捷，等.原發性高血壓病痰瘀互結、毒損心絡中醫證類的臨床流行病學調查研究［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2008，14(6):453－455.

［2］王文智，徐樹楠，徐偉超.高血壓病血瘀證機理研究述評［J］.中醫雜志，2007，48(6):560 －562.

［3］周永紅，陳利國，屈 援，等.2型糖尿病血瘀證血管內皮細胞損傷模型的研究［J］.北京中醫藥大學學報，2009，32(11):742 －746，754.

［4］劉敬順，姜 燕，安曉飛，等.血清糖基化終產物CML與2型糖尿病血瘀證患者微血管病變危險因素的相關性研究［J］.江蘇中醫藥，2010，42(2):16 －18.

［5］陳利國，胡小勤.論病證結合血瘀證血管內皮細胞損傷模型的建立［J］.中國中西醫結合雜志，2007，27(3):271－273.

［6］錢榮立.關于糖尿病的新診斷標準與分型［J］.中國糖尿病雜志，2000，8(1):5 －6.

［7］Genuth S，Alberti KG，Bennett P，et al.Follow－up report on the diagnosis of diabetes mellitus［J］.Diabetes Care，2003，26(11):3160 －3167.

［8］中國中西醫結合研究會活血化瘀專業委員會.血瘀證診斷標準［J］.中西醫結合雜志，1987，7(3):129.

［9］Chobanian AV，Bakris GL，Black HR，et al.Seventh report of the Joint National Committee on prevention，detection，evaluation，and treatment of high blood pressure［J］.Hypertension，2003，42(6):1206－1252.

［10］陳 平，章永平，喬敏敏，等.活化蛋白C對脂多糖誘導的人臍靜脈血管內皮凋亡的影響研究［J］.中國病理生理雜志，2008，24(2):270 －274.

［11］田金洲，王永炎，時 晶，等.證候模型研究的思路［J］.北京中醫藥大學學報，2005，28(6):18－21.

［12］Hirsch AT.Vascular disease，hypertention and prevention:“form endothelium to clinical events”［J］.JACC，2003，42(2):377－379.

［13］周永紅，陳利國，屈 援，等.2型糖尿病患者對人臍靜脈內皮細胞骨架及胞漿內游離鈣的影響［J］.中國老年學雜志，2009，29(15):1865 －1867.