異補骨脂素對人晶狀體上皮細胞雌激素受體表達的上調作用*

黃秀榕， 祁明信， 張可麗， 郭 娜

(福建中醫藥大學1病理生理研究中心，2附屬第二人民醫院眼科，福建 福州 350003)

近年來的流行病學調查研究和實驗研究結果［1，2］從不同角度表明老年性白內障與雌激素間存在一定的相關性。在核性、后囊下和皮質性白內障3種類型之中，女性白內障的患病率都高于男性，而當服用雌激素后，女性核性白內障患病率有所下降;單獨應用雌激素或雌激素－孕激素聯合應用的激素替代療法與降低白內障的風險有聯系，絕經后使用雌激素可減少白內障的發生，對晶狀體透光性有保護作用;典型閉經的激素水平與白內障的發生也有顯著的依從性;在對SD大鼠應用甲基亞硝脲誘導的年齡相關性白內障模型中研究發現，去卵巢后未予雌激素組晶狀體混濁眼數較給予雌二醇或雌酮組高，未用雌激素組晶狀體透光率較使用雌激素組低;抗雌激素藥他莫昔芬使用5年以上可增加發生白內障的危險，這可能與阻斷晶體氯離子通道而導致晶狀體混濁有關。而近年的實驗研究表明，很多富含植物雌激素的中藥，如補骨脂、牛膝、葛根、淫羊藿、黑升麻、虎杖等具有類雌激素活性［3］，異補骨脂素(isopsoralen，ISR)為中藥補骨脂的有效單體，歸腎、脾經，溫腎助陽，腎屬水，肝屬木，水可生木，即腎可生肝，而肝開竅于目。本實驗選取ISR作用于H2O2處理的人晶狀體上皮細胞(human lens epithelial cells，HLECs)，探討其對老年性白內障的防治作用。

材料和方法

1 材料

1.1 儀器 流式細胞儀(Flow Cytometer，FCM)(BD FACScan)、CO2培養箱(FORMA 2111)、倒置相差顯微鏡(Olympus IMT－413)、超凈工作臺(江蘇SW－CJ－IF)、微量移液器(Gilson)、冰箱(青島BCD－268)、超低溫冰箱(MDF－V5410)、電熱式壓力消毒器(上海 YXQ.SG41)、數字酸度計(上海 PHS－25)、微量電子天平(上海FA200X)、低速水平離心機(北京LD4－2)、恒溫水浴鍋(深圳HH－4)、干燥箱(上海101A－2)、自動三重純水蒸餾器(上海SZ－97)、真空泵(EF006)。

1.2 試劑 雌二醇(β －estradiol，E2)粉末，純度97%，Sigma;ISR粉末，購自中國藥品生物制品檢定所;胰蛋白酶(trypsin)為美國Gibco產品，乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)為 Augus產品，購自華美生物工程公司;DMEM培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium)干粉為Gibco產品，牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)為Amresco產品，新生牛血清(newborn calf serum，NCS)為奧地利PAA產品，購自廈門泰京生物技術有限公司;HEPES為 Amresco產品，Triton X－100、NP－40為Sigma產品，購自廈門鷺隆生物技術有限公司;兔抗人ERα、β多克隆抗體為Santa Cruz產品，異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗兔抗體，購自北京中山生物技術有限公司;青霉素系福建匯天生物藥業有限公司產品，鏈霉素為大連美羅大藥廠產品;其余試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 HLECs培養 取出保存凍存細胞的凍存管立即放入37℃水中，將溶解的細胞懸液用10倍體積以上的培養液進行稀釋，離心，除上清，反復洗滌3次。以5×108cells/L接種于培養瓶中，37℃、5%CO2培養箱培養。待細胞生長融合后進行傳代培養。

2.2 E2溶液配制 取 E2粉末0.0136 g，溶于0.5 mL無水乙醇，待完全溶解后，加無水乙醇至5 mL，配制成10－2mol/L的儲存液，分裝，－20℃凍存備用，臨用前用滅菌后的三蒸水稀釋成10－4mol/L的工作液。

2.3 ISR溶液配制 取ISR粉末0.0091 g，溶于0.5 mL無水乙醇，待完全溶解后，加無水乙醇至5 mL，配制成10－2mol/L的儲存液，分裝，－20℃凍存備用，臨用前用滅菌后的三蒸水稀釋成10－4mol/L的工作液。

2.4 核分離液配制 分別稱取BSA 0.5 g，HEPES 0.59575 g，依次將其溶解于80 mL PBS(溶解時必須待一種試劑完全溶解后，再加入下一種試劑，直至所有試劑溶解后混勻)，加入0.6 mL NP－40，補加PBS至100 mL混勻，4℃保存備用。

2.5 反應緩沖液配制 稱取BSA 2.5 g，將其溶解于180 mL PBS，加入 0.125 mL Triton X －100，補加PBS至200 mL混勻，4℃保存備用。

2.6 分組與給藥 對照組:HLECs+含10%NCS的DMEM培養液;H2O2組:對照組 +3×10－4mol/L H2O2;E2組:H2O2組 +10－8mol/L E2;ISR 組(高濃度):H2O2組 +10－5mol/L ISR;ISR組(中濃度):H2O2組+10－6mol/L ISR;ISR組(低濃度):H2O2組+10－7mol/L ISR。

各ISR組提前加藥孵育1 h后，再加入H2O2，培養24 h后進行檢測。

2.7 FCM檢測經H2O2處理的HLECs上雌激素受體 α(estrogen receptor α，ERα)和 β(ERβ)的表達取對數期生長的細胞，常規消化，收集，細胞密度為(1－2)×109cells/L，PBS洗滌1次，每組設7個平行樣本(其中一個為陰性對照);用－20℃預冷的100% 甲醇－20℃固定20 min;PBS洗滌2次，用4℃預冷的核分離液室溫處理10 min，用反應緩沖液洗滌2遍;加入含有1%BSA及1%NCS的 PBS 50 μL，混勻后室溫中放置30 min;反應緩沖液洗滌2遍，分別加入1∶100稀釋(稀釋液為0.01 mol/L的磷酸鈉緩沖液，pH7.6)的Ⅰ抗(ERα抗體、ERβ抗體)，4℃反應過夜(陰性對照組以PBS代替Ⅰ抗，其它步驟同前，以便試機、調零)，然后用反應緩沖液洗滌2遍;加入1∶50稀釋(稀釋液為0.01 mol/L的磷酸鈉緩沖液，pH 7.6)的FITC標記的Ⅱ抗，置冰上避光放置30 min;反應緩沖液洗滌2遍，加入1 mL PBS懸浮細胞，上機做流式細胞分析，檢測ERα、ERβ蛋白陽性率。

3 統計學處理

結 果

1 FCM檢測ISR對經H2O2處理的HLECs ERα表達的影響

FCM檢測結果顯示(表1、圖1):正常HLECs存在ERα的表達;H2O2組HLECs內ERα表達明顯下降，與對照組比較有顯著差異(P＜0.01);E2、ISR高、中、低濃度組的HLECs內ERα表達明顯升高，與H2O2組比較有顯著差異(P＜0.01);且隨ISR濃度的增高HLECs內ERα表達逐漸升高，呈明顯的濃度依賴關系。

表1 FCM檢測不同濃度ISR對經H2O2處理的HLECs ERα表達的影響Table 1.The effect of different concentrations of ISR on expression of ERα in HLECs incubated with H2O2(.n=6)

表1 FCM檢測不同濃度ISR對經H2O2處理的HLECs ERα表達的影響Table 1.The effect of different concentrations of ISR on expression of ERα in HLECs incubated with H2O2(.n=6)

＊＊P ＜0.01 vs control group;▲▲P ＜ 0.01 vs H2O2group.

Group ERα(%)Control 33.552 ±2.147 H2O2 21.428 ±1.491＊＊E2 31.470 ±1.536▲▲ISR(10 －5mol/L) 36.350 ±2.498▲▲ISR(10 －6mol/L) 31.402 ±1.940▲▲ISR(10 －7mol/L) 25.390 ±0.722▲▲

Figure 1.The effect of different concentrations of ISR on expression of ERα in H2O2－treated HLECs examined by flow cytometry.圖1 FCM檢測不同濃度ISR對經H2O2處理的HLECs ERα表達的影響

2 FCM檢測ISR對經H2O2處理的HLECs ERβ表達的影響

FCM檢測結果顯示(表2、圖2):正常HLECs存在ERβ的表達;H2O2組HLECs內ERβ表達明顯下降，與對照組比較有顯著差異(P＜0.01);E2、ISR高中低濃度組的 HLECs內 ERβ表達明顯升高，與H2O2組比較有顯著差異(P＜0.01);且隨ISR濃度的增高HLECs內ERβ表達逐漸升高，呈明顯的濃度依賴關系。

表2 FCM檢測不同濃度ISR對經H2O2處理的HLECs ERβ表達的影響Table 2.The effect of different concentrations of ISR on expression of ERβ of HLECs incubated with H2O2(.n=6)

表2 FCM檢測不同濃度ISR對經H2O2處理的HLECs ERβ表達的影響Table 2.The effect of different concentrations of ISR on expression of ERβ of HLECs incubated with H2O2(.n=6)

＊＊P ＜ 0.01 vs control group;▲▲P ＜0.01 vs H2O2group.

Group ERβ(%)Control 27.208 ±1.633 H2O2 15.702 ±0.613＊＊E2 25.478 ±0.906▲▲ISR(10 －5mol/L) 29.950 ±4.526▲▲ISR(10 －6mol/L) 26.120 ±2.801▲▲ISR(10－7mol/L)18.025 ±0.540

Figure 2.The effect of different concentrations of ISR on expression of ERβ in H2O2－treated HLECs examined by flow cytometry圖2 FCM檢測不同濃度ISR對經H2O2處理的HLECs ERβ表達的影響

討 論

氧化損傷是誘發老年性白內障形成的一個重要因素，如各種原因和途徑導致的晶狀體氧自由基產生過多或清除過少，均可引起HLECs和纖維組織的損傷而導致老年性白內障的發生。

ER是類固醇激素受體超大家族中的一員，人體內有2種雌激素受體，即ERα和ERβ。雌激素的生物效應主要是通過與ER結合而發揮作用［4］。已有相關研究結果證實了HLECs上有ER的表達，并在亞細胞器上的定位進行了研究［5－7］。本研究結果表明:正常HLECs上存在ERα、β表達，與國內外學者的報道結果一致。國外學者報道了氧化損傷能影響ERα、β的表達［8］。本研究表明:H2O2能下調HLECs的ERα、β表達，提示由H2O2誘導的氧化損傷參與的老年性白內障可能與HLECs的ERα、β下調有關。

近年來有相關文獻報道了E2對氧化損傷的HLECs的保護作用:Wang等［9］的研究結果表明了E2對體外培養的HLECs氧化應激的保護效應:將HLECs暴露于H2O2可引起細胞生存力、胞內ATP水平和線粒體膜電位三者呈劑量依賴性下降;而用E2預處理的HLECs，前兩者均呈劑量依賴性提高，此研究首次在HLECs中證實雌激素具有抗氧化作用。Moor等［10，11］研究發現 E2在保護 HLECs免受氧化損傷中，穩定線粒體膜電位起了關鍵作用;在H2O2處理的HLECs中，E2誘導ERK1/2磷酸化與穩定線粒體膜電位呈正相關，故可能在E2活化MAPK信號通路與穩定線粒體膜電位來發揮17β－E2的抗氧化、細胞保護作用的能力之間存在聯系，這可能是E2抗氧化的機制之一。Flynn等［12］進一步研究發現:在高糖條件下培養的牛HLECs持續產生多羥化合物，多羥化合物的聚集促進線粒體膜去極化，預先用E2處理HLECs可阻止線粒體膜電位的增加，對抗線粒體膜去極化。Gottipati等［13］的研究表明，E2可快速活化HLECs線粒體相關的錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，MnSOD)而不影響其 mRNA和蛋白的表達，推測MnSOD可能在對抗線粒體氧化損傷過程中發揮了重要作用。

E2通過受體發揮其生物學效用，在各種不同細胞上對ER的上調或下調作用［14，15］。ISR是中藥植物雌激素，已有報道ISR可使人乳腺癌T47D細胞的ERα mRNA表達顯著增加，同時也可使ERβ mRNA表達增加［14］。本研究表明:E2、ISR能上調經 H2O2處理的HLECs的ER表達，并呈明顯的濃度依賴關系，提示E2、ISR可能通過上調經H2O2處理HLECs的ER表達來發揮抗氧化損傷作用，從而起到防治老年性白內障的作用。該結果將為開發防治老年性白內障的有效藥物提供科學的實驗依據。

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