京尼平交聯的脫細胞牛心包生物支架材料的實驗研究

陳 平，李新華，邢萬紅

（山西醫科大學第二臨床醫院心胸外科，山西太原 030001）

心肌組織工程補片是利用組織工程學技術，將受體心肌細胞種植在生物可降解支架材料上，孵育出有活性的心臟補片，無需抗凝，無免疫原性，有自主修復能力，耐久性強。目前用于心肌組織工程的支架材料大體分為生物支架材料和人工高分子合成支架材料兩類，生物支架材料多使用脫細胞牛心包基質，其在細胞黏附及促細胞生長等方面優于人工合成的高分子材料[1]。本研究旨在探討去污劑-酶消化法去除新鮮牛心包組織細胞的效果和保護基質的能力，以及新型生物交聯劑京尼平對脫細胞牛心包基質作為支架材料的影響及意義，為心肌組織工程心臟補片的構建提供較理想的生物支架材料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新鮮成年牛心包（陽曲縣養牛場提供），乙二胺四乙酸（EDTA）、曲拉通-100、抑肽酶、DNAaseⅠ、RNAase A、京尼平等試劑均為Sigma公司生產。磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl液、D-Hanks液等自制，青霉素和鏈霉素購于山西醫科大學。

1.2 新鮮牛心包的處理

從養牛場采集新鮮成年牛心包，冰鹽水保存運輸，3～6 h后剔除心包表面殘留的脂肪及其他結締組織，然后4℃D-Hanks液漂洗，隨機分成三組：A組（25塊）為新鮮未脫牛心包組織，B組（25塊）為脫細胞牛心包組織，C組（25塊）為京尼平交聯的脫細胞牛心包組織；然后對B組（25塊）和C組（25塊）采用去污劑-酶消化法處理獲得脫細胞牛心包組織。

1.3 脫細胞支架材料的實驗方法

①將B組（25塊）和C組（25塊）牛心包浸入4℃、pH 8.0且含 0.05 mol/L NaCl、0.02%EDTA和 100 kIU/ml抑肽酶的0.05 mol/L Tris-HCl中24 h。②浸入4℃、pH 8.0且含1.5 mol/L NaCl、0.02%EDTA和 100 kIU/ml抑肽酶的 0.05 mol/L Tris-HCl中 24 h。③4℃，pH 7.4，D-Hanks液清洗。 ④用 4℃、pH 7.4且含1%Triton X-100、0.02%EDTA和100 kIU/ml抑肽酶的 Tris-HCl浸泡 24 h。 ⑤4℃、pH 7.4、 不含 Mg2+、Ca2+的 DHanks液清洗。⑥37℃、pH 7.6、含 DNAaseⅠ（10 mg/L）、RNAaseA（1 mg/L）、Mg2+（3mmol/L）、Ca2+（1mmol/L）的 10mmol/L Tris-HCl消化 1～2 h。 ⑦4℃、pH 7.4、含 1%Triton X-100 的 Tris-HCl浸泡 24 h。 ⑧4℃、pH 7.4 D-Hanks液浸泡 48 h。

1.4 京尼平交聯脫細胞牛心包組織

C組（25塊）采用含碘溶液[2]于37℃孵箱內作用 48 h予以消毒，然后在37℃用0.625%京尼平溶液交聯脫細胞的新鮮牛心包組織72 h[3]，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗備用。

1.5 檢測項目

1.5.1 組織學觀察 將A組、B組牛心包組織各5條置入10%甲醛溶液中固定，常規石蠟包埋、切片、HE染色后在顯微鏡下進行組織學觀察和掃描電鏡觀察。去細胞百分率=（新鮮牛心包組細胞總數－去細胞組殘留細胞數）/新鮮牛心包組細胞總數。

1.5.2 厚度、組織熱皺縮溫度測定 A組、B組和C組牛心包組織各取10片，裁成40 mm×5 mm試條，以蒸餾水為介質，從室溫開始，每分鐘升高2℃，應用熱收縮溫度測定儀和HD-10型厚度儀（精度0.01 mm）完成測試。

1.5.3 機械力學測試 將A、B、C組牛心包組織剪成5.0 cm×1.0 cm矩形條塊各10條，兩邊夾于材料性能試驗機（INSRON 5544材料性能試驗機，太原理工大學生物力學實驗室），夾持間距為15 mm。以10 mm/min將管道壁組織向兩邊拉伸，記錄最大載荷、最大應力、最大應變和彈性模量。

1.6 統計學分析

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理，數據用均數±標準差（）表示，組間兩兩比較采用t檢驗分析，三組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織學觀察

光鏡觀察顯示，脫細胞處理的牛心包為白色半透明狀，質地柔軟，未見明顯增厚。HE染色顯示，脫細胞處理的牛心包中少見細胞及碎片成分，去細胞百分率達98.63%，纖維網架結構輕度松散，但基本保持完整，纖維間的空白區為原來的間質細胞和部分細胞外基質所占據的區域，而新鮮牛心包中可見許多藍色深染的細胞核，未見明顯的空白區域（圖1、2）。掃描電鏡觀察顯示，脫細胞組牛心包組織纖維排列規則，膠原纖維無溶解變性及斷裂，纖維間細胞成分消失（圖3）。

圖1 A組光鏡顯示

圖2 B組光鏡顯示

圖3 B組掃描電鏡顯示（×20000）

2.2 組織厚度、熱皺縮溫度測定結果

組織厚度測定結果顯示，三組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；熱皺縮溫度測定結果顯示，C組分別與A組和B組比較，熱皺縮溫度差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 組織厚度及組織熱皺縮溫度結果比較（，n=10）

表1 組織厚度及組織熱皺縮溫度結果比較（，n=10）

與C組比較，*P<0.05

組別 熱皺縮溫度測定（℃） 厚度測定（mm）A組78.50±0.50*3.8±1.0 B組67.90±0.60*3.8±1.2 C組85.90±0.404.0±1.0

2.3 機械力學測試

結果見圖3。A組（圖3A）與C組（圖3B）比較，最大載荷、最大應力、彈性模量、最大應變略降低，差異有統計學意義（P<0.05）。

圖3 機械力學測試結果

3 討論

心肌組織工程支架材料是心肌組織工程研究的重要內容之一。目前應用于構建組織工程心肌支架的材料種類很多，主要分為天然生物支架材料和合成生物可降解材料。天然生物材料為滿足用作心臟補片支架材料的需要，首先必須完全脫去細胞等抗原成分，以降低材料的免疫原性。同時，選用的制備方法應盡量減少對原有結構的破壞，結構的保留有助于組織的修復和強度的保持[4-6]。

天然生物支架材料因具有抗原性低、利于細胞黏附生長、材料孔隙及孔徑優于合成材料等優點，越來越受到科研人員的重視，但存在來源有限、生物學力度較難控制等缺點。人工合成材料種類較多，質量均一性相對較好，數量不受限制，力學強度好，但存在材料孔隙及孔徑制作困難、降解產物易堆積、材料質地較硬、彈性較差等缺點。支架材料的最佳孔徑和厚度是兩者選用所面臨的共同問題。在沒有血管結構和供血系統的構建組織中，細胞所需要的營養成分是通過滲透和擴散獲得的。如果支架材料的各孔隙通透性差，厚度過大，種植在支架內部的細胞就會因無法攝取充足營養及排出代謝廢物而壞死。同時細胞與材料的黏附能力、相容性及材料的力學性能也是組織構建的關鍵問題。

牛心包膜是一種天然衍生的支架材料，主要成分是Ⅰ型膠原，含量達95.00%，柔韌性好，抗原性小，生物相容性好，來源廣泛，易于取材，由膠原纖維、間皮細胞和細胞外基質組成。其免疫原性主要取決于所含細胞的包膜表面抗原和細胞所分泌的某些特異物質，如可溶性蛋白、黏多糖等細胞外基質。因此，新鮮牛心包膜經脫細胞處理后可除去其內的細胞等抗原成分，從而大大降低了牛心包膜的免疫原性。

本實驗采用的去污劑-酶四步脫細胞方法[7-8]，以低滲、高滲透液使組織中的細胞破裂；去污劑Triton X-100破壞細胞膜磷脂和脂蛋白；蛋白酶抑制劑抑肽酶和EDTA（能與金屬離子螯合，使蛋白酶失活）抑制蛋白酶的活性，保護基質中的膠原蛋白和彈性蛋白不被水解；DNAaseⅠ和RNAase A水解細胞核中的DNA和RNA，用清洗液清洗掉細胞成分、膜磷脂、脂蛋白及細胞抗原。本實驗結果表明，處理后細胞數量極少，證明本方法脫細胞效果良好；膠原纖維和彈力纖維保存完整，僅排列較疏松，與細胞脫除有關；組織厚度略增加，與組織內水分增加有關。

機械力學測試結果顯示，脫細胞后牛心包斷裂伸長率增大，表明脫細胞后牛心包的組織疏松，變形能力增強；而抗拉負荷減小，說明脫細胞處理對牛心包的力學強度有影響。為了提高天然生物材料的強度，人們常常通過交聯反應而達到增加強度的目的[9]。傳統的交聯方法大都使用化學合成類交聯劑，而這類交聯劑本身具有相對較高的細胞毒性，導致所得的生物材料在植入受體以后會影響正常組織的生長。本實驗用天然生物交聯劑京尼平對脫細胞牛心包進行交聯，經過京尼平交聯的脫細胞牛心包最大載荷增加明顯。

京尼平是從梔子果實中提取的天然交聯劑，它是一種環烯醚萜類化合物，具有羥基、羧基等多個活性官能團。京尼平克服了常見交聯劑在處理生物組織方面的缺點，無細胞毒性，而且由其交聯的生物組織在移植后不易鈣化[10-11]。其可能的交聯機制如下：首先自發與氨基酸殘基的自由氨基反應生成一個環烯醚萜的氮化物，隨后經過脫水作用形成一個芳香族的單體，之后這一芳香族單體可能由于自由基反應的二聚作用而形成環狀的分子間和分子內交聯。京尼平交聯的最佳條件是：以0.625%為固定濃度，在中性條件下于室溫固定交聯3 d[12]。

綜上所述，采用去污劑-酶消化法處理后細胞數量極少，證明本方法脫細胞效果良好；但抗拉負荷減小，經過新型生物交聯劑京尼平交聯的脫細胞牛心包最大載荷增加顯著，可以彌補脫細胞牛心包力學性能的減少，為構建組織工程心臟補片提供較理想的生物材料。

[1]邢萬紅,徐志偉.心肌組織工程研究新進展[J].中華小兒外科雜志,2006,27(4):207-209.

[2]Moore MA,Phillips RE.Biocompatibility and immunologic properties of pericardial tissue stabilized by dye-mediated photooxidation[J].J Heart Valve Dis,1997,6(3):307-315.

[3]RatnerBD,HoffmanAS,SchoenFJ,etal.Biomaterialscience[M].SanDiego:Academic Press,1996:84-94.

[4]Oei FB,Stegmann AP,Vander Ham F,et al.The presence of immune stimulatory cells in fresh and cryopreserved donor aortic and pulmonary valve allografts[J].J Heart Valve Dis,2002,11(3):315-324.

[5]Simon P,Kasimir MT,Seebacher G,et al.Early failure of the tissue engineered porcine heart valve synergraft in pediatric patients[J].Eur J Cardio-thorac Surg,2003,23(6):1002-1006.

[6]郭鐵芳.脫細胞基質與血管內皮細胞體外相容性的研究[J].中國修復重建外科雜志,2003,17:165-168.

[7]Courtman DW,Pereira CA,Kashef V,et al.Development of a pericardial acellular matrix biomaterial:biochemical and mechanical effects of cell extraction[J].Journal of Biomedical Material Research,1994,28(6):655-666.

[8]周建業,胡盛壽,任兵,等.牛心包脫細胞基質的研制[J].中國醫學科學院學報,2001,23(2):193-195.

[9]陳強,呂偉嬌,張文清.醛交聯劑對殼聚糖復合膜性能的影響[J].華東理工大學學報:自然科學版,2005,31(3):398-402.

[10]Nickerson MT,Farnworth R,Wagar E,et al.Some physical and microstructural properties of genipin-crosslinked gelatin-maltodextrin hydrogels[J].International Journal of Biological Macromolecules,2006,38(1):40-44.

[11]Jin KH,Hwa LK,Joo JH,et al.Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract,geniposide and genipin [J].Journal of Ethnopharmacology,2006,103(3):496-500.

[12]Sung HW,Hsu HL,Shih CC,et al.Cross-linking characteristics of biological tissues fixed with monofunctional or multifunctional epoxy compounds[J].Biomaterials,1996,17(14):1405-1413.