依達拉奉對血管性癡呆大鼠學習記憶能力及海馬Chat、NR2B表達的影響

李妍博，張生林

（山西醫科大學第一臨床醫院老年病科，山西太原 030001）

依達拉奉是一種新型的腦保護藥，具有清除自由基、抗細胞凋亡和神經保護作用[1]。臨床研究結果表明，依達拉奉在腦梗死中有顯著的神經保護作用[2-3]。血管性疾呆（VD）是一組由于缺血或出血性的腦血管病及全腦缺血低氧引起的認知功能障礙綜合征。本文通過觀察依達拉奉對VD大鼠海馬Chat、NR2B表達的影響，研究依達拉奉的預防及治療作用，為VD的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型制備

實驗動物由山西醫科大學實驗動物中心提供，選用雄性Wistar大鼠 36只，體重 200～250 g，適應性飼養 2周，采用“兩血管阻斷+硝普鈉降壓法”[4]制備VD大鼠模型，B組（VD組）、C組（依達拉奉治療組）、D組（預防治療組）行雙側頸總動脈反復缺血-再灌注2次，每次10 min，同時在缺血-再灌注前給予硝普鈉2.5 mg/kg腹腔注射，A組僅暴露雙側頸總動脈而不結扎，且不注射硝普鈉。

1.2 給藥方法

C組大鼠于術后第7天給予依達拉奉皮下注射3mg/kg，D組于造模麻醉前給予同等劑量的依達拉奉，每天1次給藥，共20 d；A組與B組給予等量生理鹽水皮下注射。

1.3 學習記憶能力的測定

根據Morris水迷宮實驗進行大鼠學習記憶功能測定，歷時5 d，前4 d記錄在2 min內找到并爬上平臺的時間為大鼠的逃避潛伏期，即學習成績；第5天撤掉平臺后，記錄大鼠穿越平臺的次數以測試其記憶能力。

1.4 制備組織切片

各組動物分別于造模后第30天處死，灌洗固定后剝取海馬組織，石蠟包埋，脫蠟，應用免疫組化方法制片。

1.5 灰度值分析

各組取海馬CA1、CA3區各10個測試點，求平均值進行分析。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 水迷宮實驗結果 見表 1。

表1 各組大鼠水迷宮實驗結果（）

表1 各組大鼠水迷宮實驗結果（）

與 A 組比較，▲P＜0.05；與 B 組比較，●P＜0.05；與 C 組比較，■P＜0.05

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2.1.1 定位航行實驗結果 B組逃避潛伏期均較A、C、D組延長（P＜0.05），D 組較 C 組逃避潛伏期縮短（P＜0.05）。

2.1.2 空間搜索實驗結果 B組穿越平臺次數較A、C、D組減少（P＜0.05），D 組較 C 組次數增加（P＜0.05），說明 B 組記憶能力較其他三組均降低，D組較C組記憶能力提高。

2.2 圖像灰度值分析

與A組比較，B組海馬CA1、CA3區的Chat及NR2B表達明顯，差異有高度統計學意義（P＜0.01），C組、D組與B組比較，海馬 CA1、CA3 區的 Chat及 NR2B 表達增加（P＜0.05），但較 A 組減少（P＜0.05）。 見表 2。

表2 各組大鼠海馬 CA1、CA3區Chat、NR2B表達（）

表2 各組大鼠海馬 CA1、CA3區Chat、NR2B表達（）

與 A 組比較，■P＜0.05，▲P＜0.01；與 B 組比較，●P＜0.05

3 討論

本實驗結果表明，B組大鼠逃避潛伏期明顯延長，而C組與D組較B組均縮短，且D組與A組比較，差異無統計學意義，說明依達拉奉能夠改善VD大鼠的認知，同時說明依達拉奉有預防VD發生的作用。其機制可能與依達拉奉能夠抑制脂質過氧化、清除過量自由基、保護細胞線粒體、阻止自由基釋放而引起的遲發型的組織損害有關[5]。

Chat是膽堿能神經元的特殊標志，Chat免疫反應陽性神經元減少與大鼠學習記憶障礙程度呈正相關[6]。本實驗發現，Chat蛋白在B組海馬區表達極少，可能是因為腦組織遭受自由基的氧化損傷，導致神經細胞凋亡。在C組與D組中其表達增加可能是因為依達拉奉清除過量生成的自由基保護細胞線粒體，抑制脂質過氧化作用和血管內皮細胞損傷[2]，阻止了caspase-3的活化[7]，提高了Bcl-2的表達[8]，減少了缺血區神經細胞的凋亡。

NR2B是NMDA受體的調節亞單位，在學習和記憶中起關鍵作用[9]。腦缺血引起神經元去極化，導致谷氨酸（Glu）的大量釋放，Ca2+內流主要由谷氨酸受體的一種亞型NMDA受體通道介導，Ca2+超載造成神經元損傷，這就是Glu對神經元的興奮毒性損傷[10]。本研究中，VD大鼠海馬NR2B表達減少的機制可能與海馬缺血、低氧致神經元死亡或結構受損有關，也可能與神經元低代謝影響神經傳遞有關，而經依達拉奉干預后NR2B表達增加可能與依達拉奉能夠抑制谷氨酸釋放[11]，進而改善局部腦血流量和腦微循環及腦能量代謝有關。

本實驗發現，C組Chat及NR2B表達與D組比較，差異無統計學意義，但水迷宮實驗中D組較C組學習記憶能力提高，可能仍有其他機制的影響，有待于進一步研究。

[1]Shimon A,Tatsushi K,Chika KON,et al.Anti-apoptotic and neuroprotective effects of edaravone following transient focal ischemia in rats[J].Eur J Pharmacol,2005,516(2):125-130.

[2]Edaravone Acute Infarction Study Group.Effect of a novel free radical scavenger,edaravone(MCI2186),on acute brain infarction.Randomized,placebo-controlled,double-blind study at multicenters[J].Cerebrovas Dis,2003,15(3):222-229.

[3]Watanabe T,Tanaka M,Watanabe K,et al.Research and development of the free radical scavenger edaravone as a neuroprotectant[J].Yakugaku Zasshi,2004,124(3):99.

[4]王蕊,楊秦飛,唐一鵬,等.大鼠擬“血管性癡呆”模型的改進[J].中國病理生理雜志,2000,16(10):914.

[5]Ikeda T,Xia YX.Effect of the free radical scanvenger,3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolirr-5-one(MCI-186),on hypoxia-ischemia-induced brain injury in neonatal rats[J].Nero Lett,2002,329(1):33-36.

[6]范文輝,李露斯,劉之榮,等.血管性癡呆的動物模型、神經病理及其膽堿能機制[J].中國臨床康復,2002,6(21):3172-3173.

[7]Xiao B,Bi FF,Hu YQ,et al.Edaravone neuroprotection effected by suppressing the gene expression of the Fas signal pathway following transient focal ischemia in rats[J].Neurotox Res,2007,12(3):155-162.

[8]Miyasou T,Kwon AH,Tsuji K,et al.Edaravone prevents Fas-induced culminant hepatic failure in mice by regulating mitochondrial Bcl-xl and Bax[J].Shock,2008,30(2):212-216.

[9]Loftis JM.The N-methyl-D-aspartate receptor subunit NR2B:localization,functional properties,regulation,and clinical implications[J].Pharmacol Ther,2003,97(1):55-85.

[10]Choi DW.Calcium:still center-stage in hypoxic-ischemic neuronal death[J].J Trend Neuro,1995,18(2):58-60.

[11]李高義,陳勁草,孟肖麗,等.依達拉奉對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經保護作用的研究[J].華中科技大學學報,2008,37(1):114-116.