外陰惡性腫瘤中P21、ILK及HPV 6/11、HPV 16/18的檢測(cè)及意義

李勝水 ，葛風(fēng)芹 ，劉春在 ，許 華 ，李雙標(biāo) ，張鳳梅 ，劉 巖

(1.河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院病理科，河北滄州 061001；2.河北省滄州市傳染病醫(yī)院，河北滄州 061001；3.河北省南大港醫(yī)院，河北滄州 061103)

研究表明，外陰多種病變與人乳頭瘤病毒（HPV）感染有關(guān)，高危HPV感染則是引起外陰惡性腫瘤的重要原因之一[1]。在外陰惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中，HPV感染與P21、ILK蛋白過度表達(dá)是否存在一定的聯(lián)系，目前國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究通過免疫組化SP法及原位雜交法（ISH）檢測(cè)P21、ILK及HPV 6/11、HPV 16/18在外陰惡性腫瘤、外陰上皮內(nèi)瘤變（VIN）組織中的表達(dá)情況，進(jìn)而綜合分析在不同HPV感染的狀態(tài)下，P21和ILK的表達(dá)與外陰惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系，有助于全面理解外陰惡性腫瘤的生物學(xué)特征，為臨床診斷、治療及判斷預(yù)后提供有價(jià)值的生物學(xué)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

標(biāo)本取自1992～2009年滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院因外陰病變而行手術(shù)切除的患者，入院后均行外陰廣泛切除術(shù)加腹股溝盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)。外陰惡性腫瘤30例，其中，腺癌2例，基底細(xì)胞癌2例，外陰鱗癌26例（角化鱗癌21例，疣狀鱗癌5例）；癌組織高分化11例，中分化12例，低分化7例；病理分級(jí)G119例，G26例，G35例；腫瘤直徑≤2 cm者8例，＞2 cm者22例。全部病例術(shù)前均無放療、化療史；病程1～5年；年齡30～83歲，平均56.5歲。外陰上皮內(nèi)瘤變（VIN）21例，其中，VINⅠ 6例，VINⅡ 8例，VINⅢ 7例；年齡30～71歲，平均55.5歲。10例正常皮膚組織為對(duì)照組，其中，5例為外陰手術(shù)陰性切緣，5例正常外陰組織；年齡35～87歲，平均61.0歲。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。

1.2 主要試劑

一抗分別為鼠抗人P21單克隆抗體，鼠抗人ILK單克隆抗體，HPV 6/11、HPV 16/18原位雜交檢測(cè)試劑盒（含生物素標(biāo)記的HPV 6/11、HPV 16/18探針）和SP試劑盒。以上試劑均購(gòu)自福州邁新公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

P21及ILK檢測(cè)采用免疫組化SP法；HPV 6/11及HPV 16/18檢測(cè)采用原位雜交法。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判定

P21及HPV 6/11、HPV 16/18均顯示細(xì)胞核著色，光學(xué)顯微鏡下見到細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色；ILK在細(xì)胞內(nèi)的陽性表達(dá)主要位于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，出現(xiàn)淺或棕黃（褐）色顆粒。評(píng)分方法：參照Fomwitz綜合計(jì)分法并略加修改，行半定量分析：隨機(jī)抽樣在高倍鏡下計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞總數(shù)和陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)，然后得出陽性細(xì)胞百分率，著色強(qiáng)度按多數(shù)陽性細(xì)胞呈現(xiàn)的染色程度分為4級(jí)：陰性（-），即陽性細(xì)胞數(shù)<1%，僅極個(gè)別細(xì)胞呈現(xiàn)輕度顯色或者無顯色；弱陽性（+），即陽性細(xì)胞數(shù)<10%且≥1%；強(qiáng)陽性（+++），即陽性細(xì)胞數(shù)>60%；中度陽性（++），即陽性細(xì)胞數(shù)介于弱陽性與強(qiáng)陽性兩級(jí)之間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 10.0軟件分析，用行×列聯(lián)表χ2檢驗(yàn)，各指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 P21及ILK在各組中的表達(dá)情況

P21在外陰惡性腫瘤組、VIN組中的陽性表達(dá)率顯著高于正常組（P<0.05）；ILK在外陰惡性腫瘤組中的陽性表達(dá)率顯著高于VIN組（P<0.05），其在外陰惡性腫瘤組和VIN組中的陽性表達(dá)率均顯著高于正常組（P<0.05）。見表1。

表1 P21和ILK在各組中的表達(dá)（例）

2.2 HPV 6/11、HPV 16/18在各組中的感染情況

外陰惡性腫瘤組和VIN組中HPV 6/11陽性表達(dá)率均顯著高于正常組（P<0.05）；HPV 16/18陽性表達(dá)率與正常組比較，有顯著性差異（P<0.05）；VIN組與正常組比較，無顯著性差異（P>0.05）。 見表 2。

表2 HPV 6/11、HPV 16/18在各組中的感染情況

2.3 HPV 6/11、HPV 16/18 與 P21、ILK 的關(guān)系

HPV 6/11、HPV 16/18感染組中P21、ILK的陽性表達(dá)與無感染組比較，無顯著性差異（P>0.05）。見表3。

表3 HPV 6/11、HPV 16/18感染與無感染者P21、ILK的檢測(cè)（例）

2.4 P21與ILK、HPV 6/11、HPV 16/18的檢測(cè)與外陰惡性腫瘤的臨床病理特征及其相互關(guān)系

P21、ILK和HPV 6/11、HPV 16/18的陽性表達(dá)率與腫瘤大小、組織類型、鱗癌的病理分級(jí)、臨床分期及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移無關(guān)（rs=-0.022，P>0.05）。 HPV 6/11、HPV 16/18 與 ILK 和P21 的表達(dá)無相關(guān)性（rs=-0.020，P>0.05），ILK 與 P21 的表達(dá)也無相關(guān)性（rs=-0.015，P>0.05）。

3 討論

p21基因是CIP家族中的一員，它是位于p53基因下游的細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子。p21可以和p53共同構(gòu)成細(xì)胞周期G1檢查站，因DNA損傷后不經(jīng)過修復(fù)則無法通過，減少了受損DNA的復(fù)制和積累，從而發(fā)揮抑癌作用[2-3]。p21可以通過細(xì)胞周期調(diào)控作用間接參與細(xì)胞凋亡（依賴p53途徑）和直接導(dǎo)致細(xì)胞異化惡變（非依賴p53途徑），可以正性調(diào)節(jié)細(xì)胞依賴性激酶功能，抑制PCNA與多聚酶γ結(jié)合，影響DNA復(fù)制和抑制應(yīng)激蛋白激酶活性，可作為腫瘤分化程度及臨床分期的參考指標(biāo)之一[4]。

ILK是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)具有3個(gè)結(jié)構(gòu)單位的Ser/Thr蛋白激酶，作為整合素和生長(zhǎng)因子受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的一個(gè)重要效應(yīng)物，ILK調(diào)節(jié)著細(xì)胞的黏著、生存、分化和凋亡[5]。其相關(guān)蛋白PKB、GSK3等是細(xì)胞程序性死亡和細(xì)胞周期循環(huán)的重要調(diào)節(jié)蛋白[6-7]。這些原因使得ILK與腫瘤的形成、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和臨床預(yù)后等密切相關(guān)。目前，ILK的功能紊亂在腫瘤發(fā)生中的作用仍有大量的理論問題有待解決[8-12]。

本研究結(jié)果表明，在各級(jí)VIN中均有P21及ILK表達(dá)，且陽性產(chǎn)物定位于非典型區(qū)，推測(cè)在異常細(xì)胞增殖的轉(zhuǎn)化過程中，已有ILK及p21基因的擴(kuò)增，并可通過蛋白水平檢測(cè)出來。ILK在外陰惡性腫瘤中的陽性表達(dá)率明顯高于VIN組，表明從外陰惡性腫瘤癌前病變到浸潤(rùn)癌的發(fā)展過程中ILK起重要的作用；而P21在外陰惡性腫瘤組與VIN組中的陽性表達(dá)率相似，推測(cè)在外陰惡性腫瘤的發(fā)展過程中P21的檢出可能是一個(gè)早期事件。

本研究結(jié)果顯示，P21及ILK陽性表達(dá)與外陰惡性腫瘤的臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤的大小及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移均無關(guān)，提示在外陰惡性腫瘤中，P21和ILK的過度表達(dá)可能只對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化及惡性表型的維持有重要作用，而與外陰惡性腫瘤的預(yù)后無關(guān)。P21與ILK表達(dá)無相關(guān)性，推測(cè)在外陰惡性腫瘤中ILK的表達(dá)可能還受其他因素的影響。約1/3的外陰惡性腫瘤與HPV感染有關(guān)，在小于35歲的婦女中HPV感染率高達(dá)85%。本研究結(jié)果表明，在外陰惡性腫瘤及VIN組織中存在一定比例的HPV 6/11及HPV 16/18感染，推測(cè)HPV感染在外陰惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中起一定作用。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，HPV 6/11、HPV 16/18 感染與 P21、ILK的表達(dá)無關(guān)。

總之，外陰組織的癌變是受多種因素作用的，筆者認(rèn)為通過降低HPV感染率，對(duì)P21、ILK蛋白表達(dá)陽性的癌前病變積極干預(yù)，可以遏制細(xì)胞的持續(xù)轉(zhuǎn)化，從而在一定程度上阻止外陰惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。

[1]Garland SM,Insinga RP,Sings HL,et al.Human papillomavirus infectionsand vulvardisease development[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2009,18(6):1777-1784.

[2]Chang YW,Bean RR,Jakobi R.Targeting RhoA/Rho kinase and p21-activated kinase signaling to prevent cancer development and progression[J].Recent Pat Anticancer Drug Discov,2009,4(2):110-124.

[3]Tian Q,Lu W,Chen H,et al.The nonsynonymous single-nucleotide polymorphisms in codon 31 of p21 gene and the susceptibility to cervical cancer in Chinese women[J].Int J Gynecol Cancer,2009,19(6):1011-1014.

[4]Xu G,Wang H,He G.Expressions of p53 and p21 in nasal NK/T-cell lymphoma and their relationship with the proliferation and apoptosis of cells[J].Lin Chuang Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi,2009,23(2):73-76.

[5]Abboud ER,Coffelt SB,Figueroa YG,et al.Integrin-linked kinase:a hypoxia-induced anti-apoptotic factor exploited by cancer cells[J].Int J Oncol,2007,30(1):113-122.

[6]Honda S,Shirotani-Ikejima H.Integrin-linked kinase associated with integrin activation[J].Blood,2009,113(21):5304-5313.

[7]Eke I,Hehlgans S,Cordes N.There's something about ILK[J].Int J Radiat Biol,2009,85(11):929-936.

[8]McDonald PC,Dedhar S,Keller C.Integrin-linked kinase:both Jekyll and Hyde in rhabdomyosarcoma[J].J Clin Invest,2009,119(6):1452-1455.

[9]Lo..ssner D,Abou-Ajram C,Benge A,et al.Integrin alphavbeta 3 upregulates integrin-linked kinase expression in human ovarian cancer cells via enhancement of ILK gene transcription[J].J Cell Physiol,2009,220(2):367-375.

[10]Goulioumis AK,Bravou V,Varakis J,et al.Integrin-linked kinase cytoplasmic and nuclear expression in laryngeal carcinomas[J].Virchows Arch,2008,453(5):511-519.

[11]Wang S,Basson MD.Integrin-linked kinase:a multi-functional regulator modulating extracellular pressure-stimulated cancer cell adehesion through focal adhesion kinase and AKT[J].Cell Oncol,2009,31(4):273-289.