不同時間EBV-LMP2重組腺病毒體內細胞免疫效果研究

王 湛 周 玲 杜海軍 葉樹青 尉秀霞 曾 毅

非復制型腺病毒載體具有安全性高、宿主范圍廣泛、感染滴度高、易于重組基因操作、穩定性好、產生的大量外源蛋白接近于翻譯后水平的成熟蛋白質等優點。應用腺病毒載體攜帶目的基因，通過表達產物的生物活性或通過激發機體的免疫應答達到治療疾病的目的。非復制型腺病毒載體已經被廣泛的應用到臨床中，利用非復制型腺病毒載體表達p53基因的重組腺病毒rAd-p53已經上市，成為世界上第一個基因治療藥物。

本研究目的是觀察攜帶EBV-LMP2基因的重組腺病毒在小鼠特內誘導特異性CTL的時間規律。

1 材料與方法

1.1 病毒、試劑

重組腺病毒Ad-LMP2本實驗室提供；EBV-LMP2肽庫由北京中科亞光生物科技有限公司合成；ELISPOT試劑盒為荷蘭U-Cytech公司產品；EZ-SepTMMouse 小鼠淋巴細胞分離液由達科為生物技術有限公司提供；Biosys Bioreader 4000 PRO自動讀板儀等。

1.2 實驗動物

4～6周雌性Balb/C小鼠，SPF級，共30只。中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供（實驗動物生產許可證：SCXK-（軍）2007-004）。

1.3 劑量分組

每只小鼠均免疫2×109VP Ad-LMP2重組腺病毒。

1.4 動物免疫方法

使用1mL注射器，于小鼠脛前肌內注射給予動物，0.1mL/點，分別設0、1、2、3、4、5周，共6個實驗組，每組5只小鼠。為了盡量減少檢測誤差，采用不同時間點免疫小鼠，同一時間檢測的方案。具體方法為每周購入5只4～6周雌性Balb/C小鼠免疫Ad-LMP2，第6周時購入新的小鼠作為0周對照。1.5 ELISPOT分析

按照動物免疫方案，6周時各組小鼠統一分類脾淋巴細胞，依小鼠IFN-γ-ELISPOT分析試劑盒說明書進行檢測，特異刺激物為LMP2混合多肽。ELISPOT板每孔中分別加入2×106細胞液100μL，100μL混合多肽刺激IFN-γ的釋放，每種多肽的使用濃度為10μg/mL，只加入100μL培養基不加多肽的細胞孔做自身陰性對照。37℃，5%CO2條件培養36h，依說明進行斑點染色，ImmunoSpot計數。

2 結 果

使用LMP2多肽刺激Ad-LMP2免疫的不同時間點小鼠脾淋巴細胞，ELISPOT方法檢測釋放細胞因子IFN-γ的細胞占脾淋巴細胞的比率。結果顯示，在免疫1周的小鼠1×106脾淋巴細胞中，可以檢測到約800個LMP2特異性釋放IFN-γ的細胞，隨著免疫后時間的延長，與免疫后1周的結果相比較，免疫后2、3、4周時小鼠脾淋巴細胞中LMP2特異性釋放IFN-γ的細胞的比率沒有明顯改變，5周時略有降低，見表1和圖1。

表1 小鼠脾淋巴細胞中釋放γ-IFN細胞數（1×106脾淋巴細胞）

3 討 論

Epstein-Barr（EB）病毒屬于皰疹病毒科γ亞科，在人類廣泛傳播，為95%以上的成人所攜帶。EBV與多種人類腫瘤相關，包括鼻咽癌（NPC）等惡性腫瘤，EBV的存在為疫苗及免疫治療的研究提供了理想靶位。NPC是我國南方一些?。ㄗ灾螀^）的常見惡性腫瘤之一，與EBV健康攜帶者相比，NPC患者體內針對EBV蛋白的CTL反應明顯降低，在正常人、IgA/VCA抗體陽性人群、鼻咽癌病人體內，LMP2的特異性CTL水平呈依次下降趨勢[1,2]。

圖1 Ad-LMP2免疫后不同時間小鼠脾淋巴細胞中釋放γ-IFN細胞數（1×106脾淋巴細胞，與1周時結果比較 *為P＜0.05）

介導腫瘤相關抗原基因轉移的方法包括病毒載體及理化方法等多種途徑。腺病毒、痘病毒、逆轉錄病毒是最常用的病毒載體，尤其是腺病毒載體目前認為是最有前景的病毒載體。在全世界已開展的基因治療臨床試驗中，約70%使用了病毒載體，其中逆轉錄病毒載體和腺病毒載體使用最多，分別達27%和26%。由于腺病毒載體突出的安全性特點及比逆轉錄病毒載體稍大的外源基因容量，在Ⅱ/Ⅲ期或Ⅲ期臨床試驗中，54%使用了腺病毒載體[3]。世界上第一個基因治療藥物重組腺病毒rAd-p53已經上市，rAd-p53被用于頭頸部鱗癌、乳腺癌、食管癌、卵巢癌、腦瘤、支氣管肺泡癌等的臨床研究中。重組腺病毒感染細胞后，病毒基因組DNA以附加子方式存在，不整合入宿主基因組，病毒基因組不復制，但可以持續表達基因蛋白。吳丹莉等[4]利用表達綠色熒光GFP的重組腺病毒研究病毒的分布，結果表明，通過局部注射的方式免疫動物，注射第3天時GFP熒光最強，第7天熒光開始減弱，第14天時消失，表達持續時間不超過3周。研究發現，只在注射局部檢測到重組病毒，而在肝、肺、脾、腎、腦和睪丸等部位沒有發現，病毒在注射局部不擴散，沒有造成全身性分布，表明應用重組腺病毒在治療中更加安全。

本試驗觀察了攜帶EBV-LMP2基因的重組腺病毒在小鼠體內誘導產生的針對LMP2特異性CTL應答隨時間的變化情況，為以腺病毒做載體，以提高機體相關的細胞免疫水平為目的的基因藥物的臨床免疫方案的制定提供依據。

[1]彭朝暉,張曉志.國外重組腺病毒-p53制品對腫瘤基因治療臨床研究的概況[J].中華醫學雜志,2003,83(23):2098-2100.

[2]周玲,姚家偉,陳志堅,等.免疫斑點法檢測特異性EB病毒潛伏膜蛋白2合成肽的細胞毒T淋巴細胞[J].中華實驗和臨床病毒學雜志,2000,14(4):384-385.

[3]Mo WN,Tang AZ,Zhou L,et al. Analysis of Epstein-Barr virus DNA load,EBV-LMP2 specific cytotosic T-lymphocytes and levels of CD4CD25T cells pn patients with nasopharyngeal carcinomas positive for IgA antibody to EBV viral capsid antigen[J].Chin Med J,2009,122(10):1173-1178.

[4]吳丹莉,張友榮,勞妙芬,等.腺病毒載體介導肝細胞生長因子基因對大鼠心肌缺血的基因治療[J].科學通報,2002,47(22):1726-1729.