微生物限度檢查薄膜過濾法供試液預(yù)處理方法探討

苑思坤，李玉芝，王紅云

(河北省保定市藥品檢驗所，河北 保定 071000)

某些中藥制劑具有較強的抑菌作用，需要采用薄膜過濾法對其進行微生物限度檢查。在過濾過程中，供試品溶液中的不溶雜質(zhì)常使0.45μm微孔濾膜阻塞，從而導(dǎo)致過濾速度極慢甚至不能過濾，極大地影響了檢驗的進行。如果前期能用某種濾材過濾掉供試液含有的大量極細粉及不溶性物質(zhì)，則能極大地提高0.45μm濾膜的過濾速度，從而提高檢驗的效率和準確性。筆者考察了檢驗中常見的幾種濾材，以確定其是否可用于供試液的過濾前處理。

1 環(huán)境與儀器、材料

環(huán)境為環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)。開放式薄膜過濾器(濾孔直徑0.45μm);醫(yī)用脫脂棉(定州市寶塔衛(wèi)生材料有限公司、山東陽谷景陽崗衛(wèi)生材料廠、邢臺太行醫(yī)用材料有限公司);醫(yī)用脫脂紗布(定州市寶塔衛(wèi)生材料有限公司);中速定性濾紙(杭州富陽特種紙業(yè)有限公司)。

實驗菌株[1]為大腸埃希菌 Escherichia coli.[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus.[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis.[CMCC(B)63501]、白色念珠菌 Candida albicans.[CMCC(F)98001]、黑曲霉 Aspergillus niger[CMCC(F)98003]。

培養(yǎng)基包括營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號為080925)，玫瑰紅鈉培養(yǎng)基(批號為080925)，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號為070111)，改良馬丁培養(yǎng)基(批號為070105)。實驗菌株及培養(yǎng)基均購自中國藥品生物制品檢定所。稀釋液及沖洗液為pH=7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備[2]

分別取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌，置營養(yǎng)肉湯新鮮培養(yǎng)液中培養(yǎng)18～24 h，白色念珠菌置改良馬丁液體培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)液中培養(yǎng)18～24 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫黑曲霉孢子，按2005年版《中國藥典(一部)》微生物限度檢查法項下規(guī)定制備成50～100 CFU/mL的菌液。

2.2 濾材制備

取醫(yī)用脫脂棉5 g，制成直徑11 cm的均勻圓餅;取紗布折疊成32層，用剪刀剪成直徑11 cm的圓餅;另取濾紙一片(直徑11 cm)。將上述3種濾材在121℃下濕熱滅菌。

2.3 菌液組回收率測定

以規(guī)定濃度的菌懸液作為對照菌液A，取1 mL，培養(yǎng)，計數(shù);另將對照菌液A分別用不同濾材過濾，續(xù)濾液作為對照菌液B，取1 mL，培養(yǎng)，計數(shù)。平行做3次試驗?；厥章拾聪率接嬎?回收率=對照菌液B平均菌落數(shù)/對照菌液A平均菌落數(shù)×100%。結(jié)果見表1。可知，用醫(yī)用脫脂棉、醫(yī)用脫脂紗布過濾，回收率均接近100%，證明其對細菌、霉菌無攔截作用;采用濾紙過濾，幾種菌回收率為20%～50%，可見其對細菌、霉菌有明顯的攔截作用，不宜作為預(yù)處理用濾材。

表1 菌液組回收率測定結(jié)果(%)

2.4 樣品組回收率測定

取規(guī)定濃度的菌懸液，加等量供試液作為試驗菌液C，取1 mL，置開放式過濾器中，用1000 mL沖洗液沖洗(前期驗證試驗證明，該藥的微生物限度檢查可采用薄膜過濾法，沖洗量為1000 mL)，然后取出濾膜貼于制備好的平皿中，培養(yǎng)，計數(shù);另將試驗菌液C分別用棉花和紗布過濾，續(xù)濾液作為試驗菌液D，取1 mL，同法培養(yǎng)，計數(shù)。平行做3次試驗。回收率按下式計算:回收率=試驗菌液D平均菌落數(shù)/試驗菌液C平均菌落數(shù)×100%。結(jié)果見表2?？梢?，試驗中樣品組采用醫(yī)用脫脂棉、醫(yī)用脫脂紗布過濾，回收率均仍接近100%，證明其對細菌、霉菌無攔截作用;但試驗中發(fā)現(xiàn)，醫(yī)用脫脂紗布對極細粉和不溶性懸浮粒子的攔截作用較差，導(dǎo)致薄膜過濾困難，過濾時間甚至長達1 h，影響試驗效率;而醫(yī)用脫脂棉則能有效濾除樣品溶液中的極細粉和懸浮物。因此，對于那些含不溶性雜質(zhì)較多的供試品溶液，醫(yī)用脫脂棉是一種很好的前處理濾材。

表2 樣品組回收率測定結(jié)果(%)

2.5 醫(yī)用脫脂棉考察

考察了3個廠家的脫脂棉產(chǎn)品。結(jié)果見表3?？梢姡煌瑥S家的醫(yī)用脫脂棉，其菌液回收率無明顯差異，對細菌均無攔截作用，均適用于微生物限度檢查。另外，還考察了脫脂棉的用量(3，5，7 g)，結(jié)果用量為3 g時濾液較難通過薄膜過濾;用量為5 g和7 g時尚可，按2.3項下方法測定，回收率均無太大差異，但7 g圓餅吸附濾液較多，因此用量5 g最為合適。

表3 不同廠家醫(yī)用脫脂棉過濾樣品組回收率測定結(jié)果(%)

3 討論

結(jié)果表明，用滅菌后的醫(yī)用脫脂棉預(yù)先濾除不溶性雜質(zhì)，能在不影響試驗結(jié)果的情況下，有效增加薄膜過濾法的過濾速度，提高試驗效率，減少誤差。醫(yī)用脫脂棉具有價格低廉、濾孔細密、操作簡便快速等優(yōu)點，因此在采用薄膜過濾法的微生物限度檢查中，醫(yī)用脫脂棉作為含有較多懸浮物或其他不溶物質(zhì)的供試液的預(yù)處理材料是可行的。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:212.

[2]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2005:325.