夜香牛的質量標準研究

陳黃保，胡等芳

(廣東省湛江市藥品檢驗所，廣東 湛江 524037)

夜香牛為民間用藥，始載于《嶺南采藥錄》，別名傷寒草、消山虎、寄色草、返魂香、假咸蝦、枝香草[1－2]，為菊科植物夜香牛 Vernonia cinerea(L.)Less的干燥全草，具有清熱、除濕、解毒功效，治外感發熱、急性黃疸型肝炎、濕熱腹瀉、疔瘡腫毒。為了有效控制其質量，筆者采用顯微、薄層色譜(TLC)法進行定性鑒別，用高效液相色譜(HPLC)法測定其中木犀草苷的含量，報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀，含DAD檢測器，Agilent 1100化學工作站;梅特勒－托利多AG135型電子天平;HENGAO HS3120型超聲清洗儀(功率120 W，頻率40 kHz)。D101大孔吸附樹脂柱(批號為050901，天津市海光化工有限公司)。夜香牛于2006年5月在湛江自采，另由廣東恒誠制藥有限公司提供兩批，均經廣東省湛江市藥品檢驗所王其新主任中藥師及筆者鑒定為菊科植物夜香牛 Vernonia cinerea(L.)Less的干燥全草;木犀草苷對照品(批號為111520－200201，含量測定用，中國藥品生物制品檢定所);乙腈為色譜純;甲醇(色譜純，批號為051029101，天津市四友生物醫學技術有限公司)，水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 生藥學鑒定

來源:本品為菊科植物夜香牛 Vernonia cinerea(L.)Less的干燥全草。原植物為1年生草本，高20～80 cm。莖直立，上部有分枝，稍被灰白色短茸毛，有縱向條紋，葉互生，具柄;葉片披針形至卵形或倒孵形，長 3.5 ～6.5 cm，寬 1.5 ～3.5 cm，先端鈍或尖，基部楔形，邊緣有淺齒或波狀齒，背脈明顯，側脈3～4對，兩面均被疏毛。花全年開放，頭狀花序長約 0.7 cm，寬 0.3 cm，具柄排成疏散的傘房狀圓錐花序，總苞較花短，總苞片尖銳，小花約20朵，兩性，全為管狀花，淡紫紅色。瘦果圓柱形，灰褐色，長約0.2 cm，項端被白色冠毛[3](見圖1)。

圖1 夜香牛原植物圖

性狀:本品莖呈圓柱形，上部有分枝，長20～80 cm，直徑 0.2～0.4 cm;表面綠褐色，有縱皺紋，稍被白色短茸毛。葉互生，多皺縮或脫落，展開后呈披針形、孵形或倒孵形，邊緣有淺齒或呈微波狀。頭狀花序頂生，總苞綠褐色或黃棕色。瘦果圓柱形，灰褐色，長約0.2 cm，頂端被白色冠毛。根淡黃色，細小，多分支。質脆，易折斷，斷面髓部白色。氣微，味淡(見圖2)。

顯微特征:本品莖橫切面觀呈圓形，邊緣有突出的棱角。表皮細胞1列，呈類方形，外被角質層，并可見非腺毛，棱角處有厚角組織。皮層細胞類圓形，有的作徑向排列，內含黃綠色色素。中柱鞘纖維束呈帽狀，約16～25束斷續排列成環。韌皮部窄。形成層成環，次生木質部導管呈圓形或橢圓形，直徑8～56μm，單個散在;射線細胞2～9列;近髓部處有初生木質部。髓部寬廣，薄壁細胞較大，呈圓多角形(見圖3)。

圖2 夜香牛藥材圖

2.2 薄層色譜鑒別

取本品粉末2 g，加水50 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液加鹽酸至酸性，濾過，用乙酸乙酯振搖提取3次(每次15 mL)，合并乙酸乙酯溶液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取夜香牛對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液。照TLC法[2005年版《中國藥典(一部)》附錄Ⅵ B]試驗，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一以羧甲基纖維鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯－乙酸乙酯－甲酸－水(6∶3∶1∶3)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵試液與1%鐵氰化鉀試液(1∶1)混合溶液。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點(見圖4)。

2.3 木犀草苷含量測定

2.3.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動相:甲醇－0.2%磷酸溶液(44∶56);檢測波長:350 nm;柱溫:室溫;流速:1.0 mol/L;進樣量:20 μL。理論板數按木犀草苷峰計算應不低于3500。色譜圖見圖5。

2.3.2 溶液制備

精密稱取藥材粉末2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理(功率120 W，頻率40 kHz)30 min，取出，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過;精密量取續濾液30 mL，蒸干，殘渣加甲醇約5 mL使溶解，加到預先處理好的D101大孔吸附樹脂柱(內徑1.5 cm，柱高15 cm)上，用水50 mL洗滌，再用甲醇100 mL洗脫，棄去前15 mL，收集續洗液，蒸至近干，殘渣加甲醇30 mL使溶解，轉移至150 mL圓底燒瓶中，加入鹽酸9 mL，置水浴中加熱回流30 min，放冷，轉移至50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。取木犀草苷對照品適量，精密稱定，加2 mol/L鹽酸甲醇溶液制成每1 mL含2.5 μg的溶液，即得對照品溶液。

圖3 夜香牛莖橫切面顯微特征(×400)

圖4 夜香牛薄層色譜圖

圖5 夜香牛高效液相色譜圖

2.3.3 方法學考察

線性關系考察:精密量取對照品溶液(9.27 μg/mL)1，2，4，8，10 mL，置10 mL量瓶中，加2 mol/L鹽酸甲醇溶液至刻度，搖勻，即得每 1 mL 含 0.927，1.854，3.708，7.416，9.270 μg 的系列溶液。分別精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，依法測定，以對照品的質量濃度(μg/mL)為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y=76.32 X+0.0575，r=0.9998(n=5)。結果表明，木犀草苷質量濃度在0.927～9.270 μg/mL之間與峰面積線性關系良好。

重復性試驗:取同一批供試品(批號為060301)溶液6份，依法測定。結果的 RSD為1.5%(n=6)，表明方法重復性良好。

穩定性試驗:取同一份供試品(批號為060301)溶液，分別在制備后 0，2，4，6，8，12 h 時進樣測定。結果的 RSD 為 0.83%(n=6)，表明供試品溶液在12 h內基本穩定。

中間精密度試驗:取同一批樣品(批號為060301)6份，由A，B，C 3人分別在不同的時間用同一臺設備，依法測定。結果的 RSD為0.46%，表明中間精密度良好。

回收率試驗:取同一批(批號為060301，含量0.139 mg/g)已知含量的樣品1 g各6份，分別精密加入對照品溶液(154.5 μg/mL)0.5，1.0，1.5 mL，平行操作 2 份，依法測定，計算回收率。結果見表 1。

2.3.4 樣品含量測定

取不同樣品，依法測定其中木犀草苷的含量。結果見表2。

3 討論

TLC定性鑒別中，關于供試品溶液的制備，曾采用回流法，比較了水、70%乙醇、酸性乙醇3種溶劑，結果以水回流、加鹽酸至酸性、用乙酸乙酯提取的效果較好;還比較了乙酸乙酯－丁酮－甲酸(10∶7∶1)、甲苯(水飽和)－乙酸乙酯 －甲酸(5∶4.5∶0.5)、甲苯 －乙酸乙酯－甲酸－水(6∶3∶1∶3)的上層溶液等3種展開劑，結果以最后一種的上層溶液展開效果較好;也比較了紫外光燈(365 nm)下觀察，以1%三氯化鐵試液與1%鐵氰化鉀試液(1∶1)混合溶液為顯色劑兩種方法，結果后一種的顯色效果較好。

表1 木犀草苷回收率測定結果(n=6)

表2 樣品含量測定結果

據文獻記載，夜香牛全草顯黃酮、酚類、氨基酸等化學反應[2]，從全草中可分離得香葉木素、木犀草素、木犀草素－7－O－葡萄糖苷等有抑菌和促進消化系統蠕動作用的成分。故根據其所含成分并參照2005年版《中國藥典(一部)》中獨一味膠囊的測定方法[4]，選擇木犀草苷作為含量測定指標。在木犀草苷含量測定時，取木犀草素對照品的甲醇溶液(0.1 mg/mL)，在紫外分光光度計250～400 nm波長間掃描，結果在350.2 nm波長處有最大吸收，與文獻[4]的測定波長(350 nm)基本一致，故以350 nm為測定波長。

關于含量測定時供試品溶液的制備條件選擇，曾考察藥材的乙酸乙酯、乙醇提取液，液相色譜均末見游離木犀草苷峰，而經酸水解后高效液相色譜可見游離木犀草苷峰，說明夜香牛的木犀草苷以不同的苷類形式存在，故需水解才能測定;比較了超聲法及回流法，結果用超聲法提取效果最佳;曾分別用不同量的水、甲醇、75%乙醇、乙醇洗脫，結果用100 mL以內的水洗滌，可除去大部分水溶性雜質且對被測成分無影響，用甲醇、75%乙醇、乙醇洗脫結果無明顯差異，但以甲醇洗脫、棄去前15 mL再收集續洗液的效果稍優;曾分別將樣品置水浴中回流15，30，45 min，結果水解30 min的效果較好;曾分別加入鹽酸 4.5，9.0，11.0 mL 考察酸濃度，結果溶液中酸的濃度為2.5 mol/L時水解較適合。另外，曾對甲醇提取液不過柱直接水解，由于部分糖對測定有影響，結果回收率較低，故不宜采用。

[1]江蘇新醫學院.中藥大辭典(上冊)[M].上海:上海人民出版社，1977:916.

[2]《全國中草藥匯編》編寫組.全國中草藥匯編(上冊)[M].北京:人民衛生出版社，1978:472.

[3]中國科學院植物研究所.中國高等植物圖鑒(第四冊)[M].北京:科學出版社，1987:402.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學工業出版社，2005:541.