高效液相色譜法測定牛黃上清片中連翹苷含量

譚志藝，劉永路

(廣東省云浮市藥品檢驗所，廣東 云浮 527300)

牛黃上清片由人工牛黃、大黃、連翹、黃芩、當歸等19味中藥制成，具有清熱瀉火、散風止痛的功效，可用于治療頭痛眩暈、目赤耳鳴、口舌生瘡、咽喉腫痛、大便燥結等[1]。該藥原標準中無連翹苷含量測定項，為有效控制其質量，筆者采用高效液相色譜(HPLC)法測定方中連翹中連翹苷的含量，結果滿意。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)。連翹苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110821－2007117);樣品1(鶴壁市中藥有限公司，批號為1004012);樣品2(鶴壁市中藥有限公司，批號為1004021);樣品3(河南省百泉制藥有限公司，批號為090312);乙腈(色譜純)，水(超純水)，其他試劑(分析純)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[2]

色譜柱:Diamonsil(鉆石)C18柱(250 mm × 4.6 mm，5μm);流動相:乙腈－水(25 ∶75);檢測波長:230 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃。理論板數按連翹苷峰計算達3500以上。

2.2 溶液制備

精密稱取連翹苷對照品適量，置量瓶中，用甲醇溶解并制成40 μg/mL的溶液即得對照品溶液。取牛黃上清片20片，除去糖衣，稱定總質量，研細，混勻，精密稱取1.4 g，置具塞錐形瓶中，稱定質量，精密加入甲醇25 mL，密塞，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，用三氯甲烷振搖提取3次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，回收至干，殘渣用50%甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，濾過即得供試品溶液。按處方比例及工藝制備不含連翹的樣品適量，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

陰性干擾試驗:精密吸取對照品、供試品及陰性對照品溶液各10 μL，分別進樣測定。結果陰性對照品溶液色譜圖中在連翹苷峰相應的保留時間附近無干擾峰檢出(圖1)。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察:精密吸取質量濃度為40 μg/mL的對照品溶液 1，2，5，8，15，25 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積 Y為縱坐標、連翹苷對照品進樣量 X為橫坐標繪制標準曲線，回歸方程為 Y=71.307 X+0.1338，r=0.9999(n=6)。結果表明，連翹苷進樣量在 0.08 ～1.00 μg 范圍內與峰面積有良好的線性關系。

精密度試驗:精密吸取對照品溶液10 μL，重復進樣6次，記錄色譜圖。結果峰面積的 RSD=0.23%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗:精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別在0，1，2，4，8，18，24 h 時測定峰面積。結果的 RSD 為 0.7%(n=7)，表明待測溶液至少在24 h內穩定。

重現性試驗:取同一批號的樣品6份，依法測定。結果的 RSD為0.54%(n=6)，說明方法的重現性良好。

加樣回收試驗:精密稱取已知含量的樣品6份，分別精密加入連翹苷對照品適量，依法測定其含量，求出加樣回收率。結果見表1。

表1 連翹苷加樣回收試驗結果(n=6)

2.4 樣品含量測定

精密吸取對照品及供試品各10 μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，按外標法計算含量。結果樣品1、樣品2、樣品3的連翹苷含量分別為 10.35，10.08，25.56 μg/片。

3 討論

筆者考察了甲醇、70%乙醇溶液、50%甲醇溶液3種提取溶劑，230 nm和277 nm兩種檢測波長，乙腈－水(25∶75)、乙腈－水－冰醋酸(25∶75∶0.1)兩種流動相。結果以甲醇溶液為提取溶劑、230 nm為檢測波長、乙腈－水(25∶75)為流動相的效果較好，在此條件下色譜分離和線性關系良好，重現性及回收率結果均符合要求。

[1]WS3－B－1509－93，衛生部藥品標準·中藥成方制劑(第八冊)[S].

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學工業出版社，2005:589.