木賊有效部位抑制氧化低密度脂蛋白致內皮細胞凋亡及Caspase—3的表達

李志永+李紅艷+龐鑫+李秀芬+孔芳

摘要：目的探討木賊有效部位抑制氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導人臍靜脈內皮細胞（HUVEC-ECV304）凋亡的可能機制。方法體外ox-LDL誘導人臍靜脈內皮細胞損傷，用木賊有效部位進行干預；采用流式細胞術檢測細胞凋亡率及Caspase-3蛋白；反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測內皮細胞Caspase-3mRNA表達。結果ox-LDL可明顯誘導內皮細胞凋亡，上調Caspase-3mRNA及Caspase-3蛋白表達，木賊有效部位干預后細胞凋亡率明顯下降（P<0.05），Caspase-3mRNA及Caspase-3蛋白表達明顯下調（P<0.01）。結論木賊有效部位通過對凋亡相關基因的調控最終抑制Caspase-3蛋白的表達來減少內皮細胞的凋亡。

關鍵詞：木賊；有效部位；氧化低密度脂蛋白；內皮細胞；凋亡；Caspase-3

中圖分類號：R285.5文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2017）06-0071-03

【Abstract】Objective： To study the possible mechanism of inhibiting human umbilical vein endothelial cells （HUVEC-ECV304） apoptosis induced by oxidized low density lipoprotein （ox-LDL）. Methods： Ox-LDL in vitro was used to induce human umbilical vein endothelial cell injury and effective part of Equisetum was used to intervene. Flow cytometry was used to detect cell apoptotic rate and Caspase-3 protein and reverse transcriptase polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to detect endothelial cell Caspase-3 mRNA expression. Results： Ox-LDL could induce the apoptosis of endothelial cells and up-regulate Caspase-3 mRNA and Caspase-3 protein expression. The apoptotic rate significantly decreased （P<0.05） after the intervention of the effective part of Equisetum and Caspase-3 mRNA and Caspase-3 protein expression obviously down-regulated （P<0.01）. Conclusion： The effective part of Equisetum can inhibit the apoptosis of endothelial cells by controlling the expression of Caspase-3 protein through regulating apoptosis-related genes.

【Key words】Equisetum， effective part， oxidized low density lipoprotein， endothelial cell， apoptosis， Caspase-3

木賊為多年生草本植物，藥用部位為木賊的干燥地上部分，傳統用于“疏風散熱、解肌退翳”等作用，現代研究證實其有抗動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）的作用[1]。本課題組證實木賊大孔樹脂提取物中主要含黃酮及芬酸類化合物，這兩種成分對氧化低密度脂蛋白損傷的內皮細胞有保護作用，且筆者初步闡明其保護內皮細胞是通過抗內皮細胞凋亡機制來實現的[2-3]。本實驗通過研究木賊提取物對ox-LDL誘導的人主動脈內皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）的凋亡及Caspase-3mRNA與Caspase-3蛋白水平表達的影響，進一步探討木賊保護內皮細胞抗凋亡的具體途徑，為木賊抗動脈粥樣硬化的下一步開發利用提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料與儀器CO2恒溫培養箱，美國Revco；756MC型紫外-可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；Gen Amp5700型PCR儀，美國PE公司；FR-200A凝膠掃描系統，上海復日科技有限公司；微量移液器，美國eppendorf；Epics-XLⅡ型流式細胞儀，美國B-C公司；木賊飲片，購于石家莊市樂仁堂大藥房，經河北醫科大學中醫學院中藥系鑒定；槲皮素和阿魏酸標準品，中國藥品生物制品檢定所，批號0080-9705，0773-9910；D101型大孔樹脂，天津大均科技開發有限公司；人臍靜脈內皮細胞株ECV304，武漢大學中國動植物保存中心；新生小牛血清，四季青公司；DMEM培養液及胰酶，GIBCO公司；總RNA提取試劑（TRIzol）、cDNA第一鏈合成試劑盒、PCR試劑盒及DNA Marker，均為北京TIANGEN公司；PCR引物，北京三博遠志生物公司；Caspase-3鼠抗人多克隆抗體，美國Santa Cruz公司；羊抗兔IgG-PE二抗，美國Santa Cruz公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2木賊有效部位的制備稱取適量木賊飲片置于圓底燒瓶中，加12倍量的70%的乙醇浸泡2h，電熱套加熱回流提取3次，每次2h，過濾并合并濾液，得木賊提取液。稱取大孔樹脂40 g，將提取液上樹脂柱，先以水沖至洗脫液近無色后（Molish反應陰性）分別用蒸餾水，30%乙醇，70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液作為測試樣品，分別以槲皮素和阿魏酸為對照品用紫外分光光度計檢測此樣品中總黃酮和總酚酸含量并測定其純度。將70%乙醇洗脫液減壓濃縮后，用無血清培養基DMEM將樣品稀釋，以二甲基亞砜（DMSO）使其充分溶解，此為用于本實驗的木賊有效部位。

1.3ox-LDL的制備采用沉淀法參照文獻[4]制備。

1.4細胞培養與分組采用15%新生小牛血清DMEM作為培養液，在37℃、5%CO2培養箱中瓶養人臍靜脈內皮細胞。取對數生長期細胞15瓶，將細胞培養液換成無血清DMEM培養液，培養6h后隨機分成3組①對照組：無血清DMEM培養液；②模型組：無血清DMEM培養液培養1h后加入ox-LDL，使其終濃度為80μg/ml；③木賊有效部位組（以下簡稱有效部位組）：無血清DMEM培養液中加入木賊有效部位，使其終濃度為50μg/ml，培養1h后加入ox-LDL，使其終濃度為80 μg/ml。繼續培養12h后收集細胞和培養液進行檢測。

1.5流式細胞儀檢測細胞凋亡率及Caspase-3蛋白用胰酶消化收獲細胞并用PBS沖洗2次，1500 r/in離心5min棄上清，細胞用70%冷乙醇固定，置于-20℃保存待測。碘化丙啶染色后，流式細胞儀檢測內皮細胞凋亡率。加入Caspase-3多克隆一抗，IgG-PE二抗，進行免疫熒光數據分析。以熒光指數（FI）表示其蛋白表達的相對含量，公式：FI=（樣品平均熒光強度-對照樣品平均熒光強度）/正常對照樣品平均熒光強度。（FI>1.0為陽性，FI≤1.0為陰性）

1.6RT-PCR 按Trizol試劑盒說明書提取各組細胞總mRNA，經2%瓊脂糖凝膠電泳后，每一樣品均出現清晰的28 s和18 s條帶，且28 s條帶的亮度和寬度約為18 s條帶的2倍，純度鑒定A260/A280值為1.8～2.0。RNA的反轉錄過程及擴增過程分別按試劑盒說明書進行。Caspase-3引物序列為：上游5′-ATACTCCTTCCATCAAATAG-3′，下游5′-AACATCACAAAACCATAATC-3′，擴增產物全長411bp；內參GAPDH引物序列為：上游5′-GTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游5′-GGTGAAGACGCCAGTGGACTC-3′，擴增產物全長300bp。Caspase-3反應條件為：94℃預變性5 min，94℃變性30s，47℃退火60s，72℃延伸60 s；GAPDH反應條件為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸40 s；以上均30個循環后再72℃延伸5 min。取10 μL反應產物在2%瓊脂糖凝膠（含EB）上電泳，FR-980生物電泳圖像分析軟件分析灰度值，以目的條帶與內參照GAPDH條帶的灰度比值代表目的基因mRNA的表達水平。

1.7統計學處理實驗數據以表示，SPSS 15.0統計處理，樣本間采用單因素方差分析，S-N-K q檢驗。

2結果

2.1流式細胞儀檢測細胞凋亡率流式細胞儀分析結果顯示：模型組細胞凋亡率較對照組顯著升高，差異存在顯著性（P<0.05）。加入木賊有效部位后細胞凋亡率較模型組明顯下降（P<0.05）。見表1。

2.2Caspase-3 mRNA及Caspase-3蛋白表達與對照組比較模型組Caspase-3mRNA及Caspase-3蛋白的表達均明顯升高（P<0.01）；與模型組相比有效部位組Caspase-3mRNA及Caspase-3蛋白的表達均顯著降低（P<0.01）。見圖1及表1。

3討論

本課題組前期動物實驗及體外細胞實驗均證實木賊有保護血管內皮細胞，抑制AS形成的作用[2，5]，并進一步確定木賊有效藥理成分為黃酮及芬酸類化合物，且對其抗內皮細胞凋亡途徑進行了探討[6]。

細胞凋亡機制的核心成分是蛋白酶，細胞凋亡的過程就是蛋白酶級聯反應的過程，不同的蛋白酶在不同凋亡階段發揮其功能。Caspase蛋白都是半胱氨酸家族蛋白酶，細胞凋亡的過程實際上是Caspase蛋白不可逆有限水解底物的級聯放大反應過程。Casepase蛋白是以沒有活性的酶的前體而存在，大多數能被蛋白水解片段激活，具有使細胞解體成凋亡小體的作用。而Caspase-3蛋白是其中起非常關鍵作用的一員，在蛋白酶級聯切割過程中，Caspase-3蛋白處于核心位置，在凋亡的執行階段發揮著非常重要的作用，為凋亡過程級聯反應中起共同作用的下游分子，是凋亡級聯反應的最終執行者，被稱為死亡蛋白酶。這是因為不同的蛋白酶分別切割Caspase-3蛋白酶原，從而激活Caspase-3蛋白，活化的Caspase-3蛋白進一步又切割不同的底物，導致蛋白酶級聯切割放大，最終使細胞走向凋亡[7]。本實驗中觀察到，模型組細胞凋亡率升高的同時相應Caspase-3蛋白產生增多，表明ox-LDL可通過誘導Caspase-3蛋白的增多加速內皮細胞的凋亡而誘導內皮細胞損傷；木賊有效部位則可明顯逆轉這一趨勢，使Caspase-3蛋白表達減少相應凋亡率下降。這表明木賊有效部位可通過抑制處于凋亡核心位置的Caspase-3蛋白表達，切斷蛋白酶級聯放大過程，最終從凋亡執行階段抑制細胞凋亡。并且各組細胞Caspase-3mRNA的表達與其蛋白表達趨勢一致，進一步說明木賊有效部位是通過抑制Caspase-3基因轉錄來實現Caspase-3蛋白減少的。

經典的細胞凋亡信號傳導通路有兩條，即線粒體途徑與死亡受體途徑。促凋亡蛋白（Bax和Bad）與抑凋亡蛋白（Bcl-2和Bcl-xl）同屬Bcl-2家族成員蛋白，是線粒體凋亡途徑的調節者[8]。而Caspase-3蛋白是這兩條通路的共同路徑。筆者之前曾報道[6]木賊有效部位抑制內皮細胞凋亡途徑之一是通過下調LOX-1表達來抑制NOX4激活，進而通過調控Bcl-2mRNA及Caspase-3mRNA表達減少內皮細胞的凋亡。這提示木賊抗凋亡應該是通過線粒體途徑來完成的，通過本實驗可知這一途徑最終是通過抑制Caspase-3蛋白酶表達來實現的，這進一步明確了木賊有效部位抑制內皮細胞凋亡的通路。

參考文獻：

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[6]李志永，李玲，李麗瑋，等.木賊有效部位抑制氧化低密度脂蛋白誘導的內皮細胞凋亡及LOX-1、NOX4mRNA的表達[J].中國老年學雜志，2016，36（10）：2343-2345.

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[8]Song X，Wang B，Lin S，et al.Astaxanthin inhibiits apoptosis in alveolar epithelial cells type Ⅱ in vivo and in vitro through the ROS-dependent mitochondrial signalling pathway[J].J Cell Mol Med，2014，18（11）：2198-2212.