涼血解毒丸抗炎抗敏作用的實(shí)驗(yàn)研究

楊瑾+楊雪松

摘要：目的研究涼血解毒丸抗炎、抗敏的作用。方法采用2，4-二硝基氟苯（Dinitrofluobenzene 簡稱DNFB）造成變應(yīng)性接觸性皮炎（Allergic contact dermatitis 簡稱ACD）動(dòng)物模型和磷酸組胺致豚鼠瘙癢模型，探討“涼血解毒丸”的抗Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)作用。結(jié)果與模型組比較，涼血解毒丸組能顯著降低2，4-二硝基氟苯所致的小鼠耳廓腫脹度，能顯著抑制炎癥細(xì)胞浸潤和提高小鼠血清IL-10水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但是對(duì)IFN-γ的產(chǎn)生無明顯的影響（P>0.05）；涼血解毒丸能顯著止癢和增加磷酸酸組胺所致豚鼠瘙癢的致癢閾，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論涼血解毒丸對(duì)小鼠變態(tài)性接觸性皮炎有效，促進(jìn)抗炎因子IL-10 的產(chǎn)生和表達(dá)可能是其治療機(jī)制之一，具有抗炎、抗敏的作用，無明顯毒副作用。

關(guān)鍵詞：涼血解毒丸；抗炎；抗敏；小鼠；豚鼠

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2017）06-0068-04

【Abstract】Objective： To study the anti-inflammatory and anti-allergic effects of Liangxue Jiedu Pill. Methods： 2， 4-dinitrofluobenzene （DNFB） was used to induce model guinea pig pruritus with allergic contact dermatitis （ACD） to study the anti-type Ⅳ allergic effect of Liangxue Jiedu Pill. Results： Compared with the model group， Liangxue Jiedu Pill group could significantly reduce the ear swelling of mice induced by 2，4-dinitrofluorobenzene， inhibit the infiltration of inflammatory cells and increase serum IL-10 level， and the difference was statistically significant （P<0.05）， but there was no significant effect on the production of IFN-γ （P>0.05）. Liangxue Jiedu Pill could significantly prevent itching and increase the itching threshold of histidine-induced guinea pig pruritus， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion： Liangxue Jiedu Pill is effective in mice with allergic contact dermatitis and can promote the production and expression of anti-inflammatory factor IL-10. It is one of its therapeutic mechanisms， anti-inflammatory and anti-allergic effect and no obvious side effects.

【Key words】Liangxue Jiedu Pill， anti-inflammatory， anti-sensitive， mouse， guinea pig

涼血解毒丸是在本院全國第三批名老中醫(yī)學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承工作指導(dǎo)老師、云南省名老中醫(yī)劉復(fù)興教授自創(chuàng)的皮內(nèi)2號(hào)方—荊芩湯的基礎(chǔ)上研發(fā)的中成藥制劑（批號(hào)：滇藥制字〈Z〉20082567A號(hào)，由云南省中醫(yī)醫(yī)院制劑中心生產(chǎn)）。該方主要由荊芥、黃芩、生地黃、牡丹皮、赤芍等藥物組成，具有清熱解毒、涼血止癢之功，臨床主要用于治療中醫(yī)辨證屬血熱內(nèi)蘊(yùn)型的各類皮炎、濕疹及蕁麻疹、藥疹等多種變態(tài)反應(yīng)性皮膚病[1][2]。涼血解毒丸具有明顯抗炎、抗敏止癢的作用，且無明顯毒副作用，然而其抗炎、抗敏的作用機(jī)理，如何延緩或控制變態(tài)反應(yīng)性皮膚病的發(fā)生、發(fā)展，通過何種途徑發(fā)揮作用，都尚不明確。本文通過建立2，4-二硝基氟苯（DNFB）所致的小鼠耳廓腫脹模型，觀察涼血解毒丸對(duì)變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠炎癥細(xì)胞的抑制及對(duì)IL-10和IFN-γ表達(dá)的影響[2]，通過磷酸組胺致豚鼠瘙癢模型觀察其抗敏止癢的作用。從組織病理及分子生物學(xué)方面闡述其作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供一定的理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)通過急性毒性實(shí)驗(yàn)，觀察涼血解毒丸的毒副作用。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1動(dòng)物昆明種小白鼠，清潔級(jí)，30只，雌雄各半，體重18-22 g，合格證號(hào)：SCXK（滇）2005-0008；合格證號(hào)：0013106，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。健康豚鼠，清潔級(jí)，30只，雌雄各半，許可證號(hào)：SCXK（滇）2005-0008；合格證號(hào)：0021861。由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2藥物涼血解毒丸（批號(hào)：滇藥制字〈Z〉20082567A號(hào)），80 g/瓶，云南省中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，由云南省中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供。醋酸地塞米松片，0.75 mg/片，浙江仙琚制藥股份公司，國藥準(zhǔn)字：H33020822，批號(hào)：130644。0.9%氯化鈉注射液，國藥準(zhǔn)字H52020069，250 mL/瓶，貴州天地藥業(yè)有限責(zé)任公司出品，批號(hào)A13061504；馬來酸氯苯那敏片（撲爾敏片）：4 mg/片，昆明振華制藥廠有限公司，批號(hào)：20130501。0.9%氯化鈉注射液，國藥準(zhǔn)字H52020069，250 mL/瓶，貴州天地藥業(yè)有限責(zé)任公司出品，批號(hào)A13061504。

1.3主要試劑及儀器小鼠IFN-γ ELISA 檢測試劑盒、小鼠IL-10ELISA 檢測試劑盒（深圳晶美生物有限公司提供）；磷酸組胺：成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：201305011，分析純。2，4-二硝基氟苯（DNFB）：武漢福鑫化工有限公司，批號(hào)：201206012，分析純。8mm耳腫打耳器YLS-Q4，購自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)設(shè)備站。NewClassic MF電子分析天平：梅特勒-托利多（METTLER TOLEDO）公司生產(chǎn)，顯微鏡、酶標(biāo)儀，電動(dòng)剃毛器等。

1.4給藥劑量

1.4.1涼血解毒丸劑量經(jīng)人和動(dòng)物的等效劑量系數(shù)換算，標(biāo)準(zhǔn)體重小鼠給藥劑量為11 mg/kg；標(biāo)準(zhǔn)體重豚鼠給藥劑量為5.5 mg/kg。

1.4.2醋酸地塞米松片給藥劑量參考文獻(xiàn)[2]方法，小鼠給藥劑量為0.01 g/kg。

1.4.3撲爾敏片給藥劑量參考文獻(xiàn)[3]方法，確定豚鼠給藥劑量為5.5 mg/kg。

1.4.4急性毒性實(shí)驗(yàn)給藥劑量涼血解毒丸分別一次給藥劑量為200 mg/kg。

1.4.5主要試劑配制以4：l的丙酮：橄欖油配成0.5%、0.2%兩種濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1涼血解毒丸對(duì)2，4-二硝基氟苯（DNFB）所致小鼠耳廓腫脹的影響

2.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、給藥與造模[2]健康昆明種小鼠，30只，雌雄各半，隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字表法）分成3組，分別為模型空白組，陽性對(duì)照組（醋酸地塞米松組），涼血解毒丸組。除模型空白組給予等體積生理鹽水外，參考文獻(xiàn)[3]方法，陽性藥組（醋酸地塞米松組）每日給藥量為0.01 g/kg，涼血解毒丸組按照人和動(dòng)物的等效劑量系數(shù)計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)體重小鼠給藥劑量為11 mg/kg，每只動(dòng)物按0.2 mL/10 g體質(zhì)量灌胃，連續(xù)灌胃給藥7 d。實(shí)驗(yàn)前一天在腹部固定部位3 cm×3 cm用剪刀及剃須刀去毛，實(shí)驗(yàn)第1、2天致敏期于去毛部位涂0.5%DNFB，每天1次，每次20 μL，第3、4、5天不涂藥，第一次致敏后的第6天，用0.2%DNFB溶液20 μL涂抹在小鼠左耳兩面進(jìn)行免疫攻擊。右耳單涂丙酮：橄欖油（4：1）溶劑作為對(duì)照；涂耳24 h后處死，沿耳廓基線剪下兩耳。

2.1.2觀察指標(biāo)計(jì)算誘發(fā)后左右耳組織塊重量之差。

2.1.2.1小鼠耳片重量差小鼠處死后，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑8mm的耳腫打耳器在耳中部打孔，取下相同大小的組織塊，稱取其重量。用分析天平稱得每個(gè)組織塊的重量。計(jì)算誘發(fā)后左右耳組織塊重量之差。

2.1.2.2病理變化及炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)[4]處死小鼠后，耳部皮損組織用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，HE 常規(guī)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組病理變化，并用網(wǎng)型目鏡測微尺計(jì)數(shù)單 位面積真皮層最密集炎細(xì)胞浸潤區(qū)的多形核細(xì)胞及單一核細(xì)胞數(shù)（個(gè)/mm2）。

2.1.2.3檢測血清IL-10、IFN-γ水平[4]實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，摘除小鼠眼球，眼眶內(nèi)取血，抗凝血在4℃下3000 r/min離心30 min，獲取血漿，利用ELISA檢測血漿中IL-10、IFN一γ的濃度。

2.2涼血解毒丸對(duì)磷酸組織胺致癢作用的影響

2.2.1目的了解涼血解毒丸對(duì)磷酸組織胺致癢作用的影響。

2.2.2分組、給藥、造模[5]與檢測指標(biāo)豚鼠30只，雌雄各半，隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字表法）分為模型組，陽性對(duì)照組（撲爾敏組），涼血解毒組。除模型組給予等體積生理鹽水外，參考文獻(xiàn)[4]方法，撲爾敏陽性對(duì)照組灌胃給予撲爾敏（0.96 mg/kg）、涼血解毒丸組給予涼血解毒丸5.5 mg/kg灌胃，每只動(dòng)物按1 mL/100 g體質(zhì)量灌胃.連續(xù)給藥7 d。于第6天給藥后剔除各組豚鼠右后足背部的毛.第7天末次給藥后1 h內(nèi)用砂紙分別擦傷各組豚鼠右后足背部剃毛處，面積約1 cm2。于末次給藥1 h后開始分別在各組豚鼠右后足創(chuàng)傷處滴0.01%組胺磷酸溶液0.05 mL。此后每隔3min分別依次遞增組胺的濃度（0.01%、0.02%、0.03%），每只每次滴0.05 mL，直至豚鼠出現(xiàn)回頭舔右足時(shí)，停止實(shí)驗(yàn)，記錄磷酸組胺的滴加次數(shù)，換算成磷酸組胺滴加總量。

2.2.3統(tǒng)計(jì)方法使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料均使用（x±s）表示。兩獨(dú)立樣本的計(jì)量資料比較若呈正態(tài)分布，并具有總體方差齊性，則采用t檢驗(yàn)，若不具有總體方差齊性，則使用t檢驗(yàn)。兩組以上數(shù)據(jù)比較若具有總體方差齊性則采用單因素方差分析，多組數(shù)據(jù)間的兩兩比較使用Least-Signfieant-diffrne（LSD）方法；兩組以上數(shù)據(jù)比較若不具有總體方差齊性，則使用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)，兩兩比較使用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)。以上統(tǒng)計(jì)方法，均以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1涼血解毒丸對(duì)2，4-二硝基氟苯（DNFB）所致小鼠耳廓腫脹的影響見表1。

3.23組小鼠白血清IL-10水平比較見表2。

3.33組小鼠炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)、IFN-γ水平比較見表3。

3.43組對(duì)磷酸組織胺致癢作用的影響見表4。

3.5急性毒性試驗(yàn)對(duì)照組和涼血解毒丸組小鼠均存活，肝臟解剖未見明顯異常，表明涼血解毒丸無毒副作用，安全有效。

4討論

該研究通過用DNFB建立小鼠ACD模型，把小鼠耳廓作為皮炎的靶部位，通過炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)和對(duì)細(xì)胞因子的影響來觀察藥物的抗炎作用。

涼血解毒丸和醋酸地塞米松連續(xù)灌胃給藥7 d后，組織學(xué)檢查示涼血解毒丸和地塞米松均可明顯抑制小鼠右耳中單一核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤和充血水腫，說明涼血解毒丸與醋酸地塞米松片均具有抗炎的作用，但涼血解毒丸的抗炎作用并不優(yōu)于醋酸地塞米松。

在對(duì)細(xì)胞因子IL-10產(chǎn)生影響的實(shí)驗(yàn)中，陽性藥地塞米松和涼血解毒丸藥物均顯著提高具有免疫抑制活性細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生水平，提示地塞米松和涼血解毒丸均通過提高細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生水平來達(dá)到抗炎的作用，但涼血解毒丸并不優(yōu)于醋酸地塞米松。在對(duì)IFN-γ產(chǎn)生影響的實(shí)驗(yàn)中，地塞米松組IFN-γ產(chǎn)生顯著減少，差異有顯著性意義（P<0.01），然而涼血解毒丸對(duì)小鼠細(xì)胞因子IFN-γ產(chǎn)生無明顯的影響（P>0.05），說明地塞米松通過降低IFN-γ的水平，進(jìn)而發(fā)揮抗炎癥作用，但涼血解毒丸對(duì)IFN-γ水平的影響不顯著。

在炎癥過程中產(chǎn)生的細(xì)胞因子可分為5類，其中IL-10是免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，能減少LPS和IFN-γ誘導(dǎo)的單核/巨噬細(xì)胞釋放IL-6、IL-8、TNF-α等前炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)抗炎介質(zhì)如可溶性TNFR的釋放，還可抑制CD4+T細(xì)胞的增值和細(xì)胞因子的分泌，包括Th1生成IL-2、IFN-γ和Th2生成IL-4、IL-5，同時(shí)還可抑制中性粒細(xì)胞合成和釋放促炎介質(zhì)[6]。而IFN-γ屬于激活巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)加重炎癥[1]。

瘙癢是變態(tài)反應(yīng)性皮膚疾病常見癥狀之一，其發(fā)病機(jī)制研究尚不完全清楚，可能與諸多因素有關(guān)，有大量研究表明，組胺是一種可以引起皮膚瘙癢的重要介質(zhì)[1]，主要儲(chǔ)存在嗜堿粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞的顆粒內(nèi)。實(shí)驗(yàn)采用外源性組胺誘發(fā)豚鼠瘙癢的方法，與模型組比較，豚鼠局部致癢閾值明顯提高（P<0.05），提示涼血解毒丸有抗瘙癢的作用。

涼血解毒丸臨床應(yīng)用已10多年，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明其組方中的黃芩、丹皮、赤芍、紫草、荊芥均有一定的抗炎作用，對(duì)I、II、III和Ⅳ變態(tài)反應(yīng)均有抑制作用，對(duì)白介素、IFN-γ等細(xì)胞因子的表達(dá)水平均有影響[7][8]，為組方的合理性提供了一定現(xiàn)代藥理學(xué)依據(jù)，但中藥復(fù)方通常作用于機(jī)體多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)，是個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)，故有必要進(jìn)一步深入研究，闡明其抗炎的作用機(jī)制，并通過急性毒性試驗(yàn)從科學(xué)角度驗(yàn)證其毒副作用。

通過以上的研究表明，涼血解毒丸具有較為明確的抗炎作用，促進(jìn)抗炎因子IL-10 的產(chǎn)生和表達(dá)可能是其治療機(jī)制之一；其抗敏止癢的機(jī)制可能與抑制肥大細(xì)胞脫顆釋放組胺等炎癥介質(zhì)，產(chǎn)生了類似H1受體拮抗劑的作用，從而抑制了組胺與靶點(diǎn)的相互作用有關(guān)。

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