噬菌體法快速檢測痰中結核分枝桿菌的臨床應用

李志媛*馮 爽 張 立 李曉珉

結核病細菌學檢查是診斷肺結核及判定療程的金標準,快速有效的細菌學檢測是國內外研究的重點,也是結核病診斷的重要依據。利用噬菌體生物擴增法（Pha B assay）快速檢測結核菌近年來在結核診斷研究中備受關注[1]。筆者采用Pha B法快速檢測結核分枝桿菌標準株和肺結核患者的痰標本，均取得了理想結果，并與BACTEC-960法進行對比，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）分枝桿菌菌株：結核分枝桿菌標準株H37RV購自北京結核病研究所，在L－J羅氏培養基上生長3周后，用生理鹽水洗下后研磨，采用麥氏比濁法比濁，稀釋至1 g/L。（2）標本來源：40例痰標本取自我院2008年1月臨床確診為肺結核的住院患者深咳留取的合格痰標本。（3）試劑盒：FAST Plaque TBTM結核分枝桿菌快速診斷試劑盒購自上海金浩科技發展有限公司。BACTEC－960及其液體培養基購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體法 按照FAST Plaque TBTM試劑盒說明書配制所需試劑，包括痰處理液、培養基、瓊脂、噬菌體、敏感細胞等。所有操作均在無菌條件下進行。（1）臨床標本前處理：加等倍體積4%NaOH前處理液，渦旋震蕩混勻，20 min后，加入15 mL C液（FPTB增強培養基）。充分混勻，10 000 r/min，離心20 min棄去上清液。沉淀物加1 mL C液混勻，轉移0．5 mL至無菌反應管中備用。（2）噬菌體浸染：取0.5 mL處理后的標本加入反應管中，加入0．1 mL噬菌體溶液充分混勻，使反應管的內壁完全濕潤，以保證殺毒劑與噬菌體充分接觸，37℃孵育1 h。設置的陰性對照為反應管中不加標本，陽性對照為反應管中加入106稀釋的敏感細胞。（3）中止浸染：加入0．1 mL殺毒劑，充分混勻，室溫放置5 min后加入5 mL培養液和1 mL指示細胞。（4）澆注平皿與培養：上述混合培養液與5 mL溶解瓊脂液快速混勻后倒入無菌平皿中，待凝固成形，置于37℃培養18～24 h。（5）結果觀察：對于FAST Plaque TBTM質控檢測結果，陽性及陰性對照應該在如下范圍，陽性對照≥20個噬菌斑，陰性對照≤10個噬菌斑。對于FAST Plaque TBTM標本檢測，結果應該在如下范圍，陽性結果≥20個噬菌斑，陰性結果≤19個噬菌斑。

1.2.2 BACTEC-960法檢測 按儀器與試劑說明操作。

1.3 統計學方法 計數資料行χ2檢驗。

2 結果

2.1 標準菌株 標準菌株H37Rv結核分枝桿菌應用Pha B法檢測為陽性,在培養皿中可見到密布的噬菌斑。

2.2 2種方法檢測結果比較 對40份肺結核患者的痰標本應用Pha B法和BACTEC-960法進行檢測，結果見表1。2種方法檢測肺結核患者痰標本的陽性率相近，差異無統計學意義（χ2＝0．67，P＞0．05）。Pha B法與BACTEC－960法的陽性符合率為84%（21/25），陰性符合率為86．7%（13/15），總符合率為85%（34/40）。

表1 Pha B法與BACTEC-960法檢測結果比較

3 討論

結核病細菌學快速檢查歷來是國內外學者關注的熱點。Wilson等在1997年開發了一種新的方法,利用裂解性噬菌體裂解分枝桿菌的特性來判斷結核桿菌的有無,此法即為Pha B，基本原理是分枝桿菌噬菌體能感染活的分枝桿菌，未進入感染菌體內的噬菌體被隨后加入的殺毒劑滅活，已進入菌體內的噬菌體不受影響。噬菌體在感染菌體內大量增殖，并將菌體裂解，釋放出子代噬菌體可感染隨后加入的指示細胞，并將其裂解，在瓊脂平板上出現透亮的噬菌斑。因此，只要根據噬菌斑的有無及其數量多少，即可判斷待檢標本中是否存在活的結核分枝桿菌（MTB）或其他少數幾種非結核分枝桿菌（NTM）。

Albert等[2]曾在對噬菌體法研究中發現以L-J培養為標準,噬菌體法的靈敏度為70．3%，特異度為99．0%，陽性預測值（PPV）和陰性預測值（NPV）分別為92%和95%；對涂陰組的694份標本檢測的靈敏度為48．8%，特異度為99．2%。龐茂銀等[3]在噬菌體法與Bactect-460培養的比較研究中發現兩者陽性率無差異，兩者的陽性符合率為82．9%，陰性符合率為73．7%，總符合率為80%。這些研究表明噬菌體法與L-J和Bactect-460培養法有很好的相關性，靈敏度和特異度均比涂片法要高。本文的研究結果與上述文獻報道的結論基本相近。筆者體會，噬菌體裂解法快速、簡便，可以確定標本中有無活的結核分枝桿菌，但在實際檢測中存在諸多影響因素，因而檢測結果并非絕對準確，可作為結核病的初篩實驗。

[1]呂斌,徐順清,陳志飛，等.用重組噬菌體檢測結核分枝桿菌耐藥性[J].中華檢驗醫學雜志,2000,23(5):144-147.

[2]Albert H,Heydenrych N,Brookes R,et al.Performance of a rapid phage-basedtest,FastplaqueTB,todiagnosepulmonary tuberculosis from sputum specimens in South Africa[J].Int J Tuberc Lung Dis,2002,6(6):529-537.

[3]龐茂銀,胡忠義,王奕峰,等.噬菌體裂解法與BACTECT460法在結核分枝桿菌快速檢測中的比較[J].中華傳染病雜志,2003,21(1):27-29.