胰島素抵抗對血小板內磷脂酰肌醇3-激酶活性影響的研究*

皮淑芳 邸阜生 王懷禎 王 禹 李 鑫

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是機體組織或靶細胞對胰島素的作用缺乏正常反應,其敏感性和反應性降低的一種代謝狀態[1]。IR能夠引起肥胖、高脂血癥、高血壓、糖尿病等多種疾病。近年研究發現IR可使血小板活化，表現為血小板黏附率、聚集率增加，易于血栓形成。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K）是血小板活化信號傳導通路中的關鍵酶，本研究旨在探討IR對血小板內PI3-K活性的影響，進一步明確IR導致血小板活化的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 德國比格犬24只，雌雄不拘，月齡8～10個月，平均體質量（10．8±1．2）kg，購于軍事醫學科學院實驗動物基地。

1.2 試劑與儀器PI3-K多抗、堿性磷酸酶二抗購自北京中山試劑公司，Satacruz公司生產；血小板激活劑（ADP，20 μmol/L，美國Biopool公司）；聚集儀（LBY-NJ2型,北京普利生）；黏附儀（中國醫學科學院血液學研究所）；流式細胞儀（FACSort Calibur型,美國Becton Dickion公司）；微量泵（SP-100 s型，JMS公司）；蠕動泵（DDB-320型，上海之信儀器有限公司）。

1.3 造模與分組24只動物隨機分為2組：對照組12只，普通喂養，于每天08:00、16:00給予常規膨化飼料（購自軍事醫學科學院實驗動物中心）投喂。每100 g飼料含粗蛋白28.2 g，脂肪3.6 g。每只動物每日進食約400 g，攝入總熱量65 kcal/kg（1 kcal=4.184 0 kJ），其中蛋白及碳水化合物占81%，脂肪占19%；實驗組12只，給予高脂喂養，擬建立IR動物模型[2]，每1 000 g常規實驗室飼料增加熟牛油150 g，每只動物每天進食約500 g，攝入總熱量156 kcal/kg，其中蛋白及碳水化合物占47%，脂肪占53%。2組動物喂養6個月后進行正常血糖-高胰島素鉗夾試驗，確認其是否存在IR[3]，實驗以葡萄糖輸注速度（glucose infusion rate，GIR）表示，輸注速度慢，說明胰島素降低血糖的有效性減低，可以認定機體存在IR。

1.4 檢測指標2組動物喂養6個月后取清晨空腹靜脈血,測定相關指標：體質量（BM）、空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINS）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、血小板黏附率（玻球法）、血小板聚集率（比濁法）。以血小板黏附率、聚集率反映血小板活化狀態。其中血小板內PI3-K活性測定采用流式細胞儀分析技術，方法為：PI3-K多抗10 μL，加入動物靜脈血標本10 μL，37℃溫育30 min，加入堿性磷酸酶標記二抗4 μL，溫育30 min，流式細胞儀測定結果,PI3-K表達百分率即代表PI3-K活性。

1.5 統計學處理 采用SPSS 12.0進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組動物相關代謝指標及正常血糖-高胰島素鉗夾試驗 實驗組動物高脂喂養6個月后，BM、TC、TG、FPG、FINS均明顯高于對照組，GIR低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），實驗組動物存在IR，見表1。

表1 2組動物相關代謝指標及正常血糖-高胰島素鉗夾試驗結果比較 （n＝12±s）

表1 2組動物相關代謝指標及正常血糖-高胰島素鉗夾試驗結果比較 （n＝12±s）

*P＜0．05，**P＜0．01

對照組實驗組t BM（kg）10.43±1.33 13.69±1.41 4.11**TC(mmol/L)4.57±0.62 5.84±0.73 3.97**TG（mmol/L）0.51±0.07 0.78±0.06 6.12**FPG（mmol/L）4.82±0.89 5.51±0.62 2.20*FINS(IU/L)1.29±0.28 2.49±0.28 1.53**GIR［mg/（kg·min）］5.42±0.89 3.39±0.55 6.75**組別

2.2 2組動物血小板黏附率、聚集率及PI3-K活性結果比較 實驗組動物的血小板黏附率、聚集率、PI3-K活性明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），見表2。

表2 血小板黏附率、聚集率、PI3-K活性結果比較（%±s）

表2 血小板黏附率、聚集率、PI3-K活性結果比較（%±s）

*P＜0．05，**P＜0．01

組別對照組實驗組t PI3-K 57.19±4.17 61.02±2.67 2.68*黏附率34.83+4.76 48.16+7.63 5.14**聚集率23.83+5.65 33.67+6.53 5.5**

3 討論

目前建立IR動物模型最常用的方法為高脂喂養，高脂血癥造成IR的中心環節是脂肪細胞產生前炎癥細胞因子，分泌過量的腫瘤壞死因子α、游離脂肪酸、白介素-6等，這些物質引起機體氧化應激反應，產生活性氧，干擾細胞胰島素信號傳導，導致IR。本研究中，實驗組動物高脂喂養半年后經正常葡萄糖-高胰島素鉗夾試驗確認存在胰島素抵抗，證實了高脂喂養方法建立IR動物模型的有效性。

本研究實驗組動物血小板黏附率、聚集率高于對照組，提示IR可以引起血小板活化，這與相關研究結果一致[4-5]。目前研究認為血小板的活化是通過磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B-一氧化氮-環一磷酸鳥苷（PI3-K-AKT-NO-cGMP）這一信號途徑實現[6-7]。這一理論指出血小板活化過程中PI3-K首先活化Akt，再經過NO-cGMP信號途徑調節血小板活化反應。PI3-K的最終作用底物是來自膜磷脂的磷脂酰肌醇（PtdIns）,催化其肌醇環上的第3位羥基磷酸化，生成磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸[PtdIns（3，4）P2]和磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸[PtdIns（3，4，5）P3]，它們定位于血小板膜骨架蛋白，使血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIa形成復合體分布于血小板膜表面，并暴露纖維蛋白原結合位點，使血小板活化，發生黏附、聚集反應。PtdIns（3，4，5）P3還可以調節血小板內激酶活性引起血小板釋放反應[6]，將貯存在致密體、α-顆粒或溶酶體內的二磷酸腺苷（ADP）、三磷酸腺苷（ATP）、5-羥色胺、Ca2+等許多物質釋放，這些物質是強烈的血小板激活劑，使血小板反應迅速放大，引起血小板活化的正反饋。因此PI3-K對于血小板活化具有重要意義。本研究中實驗組動物PI3-K表達增加，說明IR可以引起PI3-K活性增強，即在IR狀態下血小板內PI3-K-AKT-NO-cGMP信號途徑處于活躍狀態，引起血小板活化，這與實驗得出的存在IR的動物血小板黏附率、聚集率增高的結果相符合。

目前關于IR對PI3-K活性影響的相關研究尚少，對血小板內PI3-K活性有直接影響的是血小板膜流動性的改變。本研究中IR動物存在體質量增加、高血脂、高血糖、高胰島素血癥等多種代謝紊亂，與相關研究結果一致[8]。其中，高血糖可以通過糖基化終產物減弱血小板的膜流動性，這種改變作為一種物理信號引起血小板內非受體性酪氨酸激酶的激活，并進一步激活PI3-K，但在IR引起的其他代謝異常中，還有哪些因素可以引起PI3-K活性改變，尚有待進一步研究。

[1]儲毓舜,梁靜,張成,等.胰島素抵抗與冠心病危險因素的相關性分析[J].天津醫藥,2008,36(6):427-429.

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