鹽酸多奈哌齊對側腦室注射 Aβ25-35大鼠海馬腦源性神經營養因子表達的影響

王亮亮,王 哲,高旭紅,李黎黎,馬中子,孟憲峰

腦源性神經營養因子 (brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)是神經營養因子家族的一個重要成員,廣泛分布于中樞神經系統,具有重要的神經保護作用并對學習記憶功能有重要的作用[1-2]。同時,研究還發現阿爾茨海默病 (Alzheimer disease,AD)患者海馬、皮質、基底前腦神經元中 BDNF和它的受體 (tyrosinekinaseB,trkB)表達明顯下降,提示BDNF可能與 AD呈一定的相關性[3-5]。因此探討 BDNF在 AD患者腦內表達下降的原因,并尋找有效藥物以抑制細胞內下調BDNF表達的信號通路或增加細胞內 BDNF表達成為治療 AD的措施之一。鹽酸多奈哌齊 (donepezil,DN)作為一種乙酰膽堿酯酶抑制劑廣泛用于 AD的治療,近幾年的研究發現除以上的機制外,其對 AD神經元還有保護作用,使神經元免于丟失[6]。但其是否能通過影響 AD患者腦內 BDNF的表達而發揮神經保護作用的研究還較少,故本研究通過向大鼠側腦室注射微量 Aβ25-35建立 AD動物模型[7],然后予以 DN治療,通過免疫組化及免疫印跡方法觀察大鼠海馬區 BDNF的表達變化,以期探討 DN對 AD腦內神經元保護的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 相同環境下飼養的清潔級雄性 Wistar大鼠 24只 (中國醫科大學實驗動物部,許可證號:SYXK[遼]2003-0013),3月齡,體質量 (200±20)g,采用數字表法將大鼠隨機分為對照組、模型組和干預組。

1.2 手術及給藥方式 采用大鼠側腦室內定點注射方法:用0.9%氯化鈉溶液將 Aβ25-35制備成質量濃度為 2μg/μl的Aβ25-35溶液,37℃孵育 1周,形成聚合狀態的 Aβ25-35[8]。模型組大鼠經水合氯醛 (30mg/kg)麻醉后,備皮,置于腦立體定位儀上,固定頭部。常規消毒皮膚,沿顱頂中線剪開皮膚,暴露頭骨及前囟,參照 George等[9]介紹的方法選定側腦室注射位點。于前囟后 0.8mm,矢狀縫旁 1.5mm處,用牙科鉆鉆開顱骨,微量加樣器吸取 Aβ25-35溶液 7.5μl,垂直進針,達蛛網膜下 3.0mm處,緩慢注射,5min內完成,留針 5min后取出。對照組給予同等劑量的 0.9%氯化鈉溶液。清潔創面后縫合皮下組織和皮膚,對合好切口,強力碘消毒,待大鼠清醒后放回籠中常規飼養。干預組造模后腹腔注射 DN 1.5mg·kg-1·d-1,連用 4周;對照組、模型組給予等量0.9%氯化鈉溶液進行腹腔注射。

1.3 免疫印跡法檢測 BDNF的表達 大鼠頸椎脫臼處死,斷頭,剝離并取出雙側海馬結構,剪碎后加入 10倍于其體積的4℃預冷的腦組織裂解液 (每毫升含 PMSF6μl,現用現加),靜置 30min后勻漿離心 (4℃,13000r/min,30min),取上清液。采用 Bradford法測定蛋白濃度,按體積比加上樣緩沖液,100℃煮 5min,等量上樣后進行 SDS-PAGE電泳,5%濃縮膠中 (80V,0.01A),12%分離膠中 (120V,0.02 A),然后半干轉印到聚偏氟乙烯 (PVDF)膜上 (50V,2 h),5%脫脂奶粉室溫封閉 2h,分別加兔抗大鼠 BDNF(1∶800),抗 GAPDH抗體 (1∶1000)4℃孵育過夜,濃縮型辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗 (1∶1000)37℃孵育 2h。入 MF-ChemiBIS3.2(DNRBio-ImagingSystem)成像儀。成像后以 Scionimage軟件 (ScionCorporation)測量目的條帶的光密度值,并將各條帶的光密度值以相應 GAPDH條帶的光密度值進行校正。

1.4 統計學方法 計量資料以 (x±s)表示,應用 SPSS 11.5軟件單因素方差分析進行組間比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

3組大鼠海馬腦神經元中 BDNF的免疫印跡結果如圖 1所示,在相對分子量為13kD處有一清晰的 BDNF條帶,Western blotting成像后以 Scionimage軟件 (ScionCorporation)測量目的條帶的光密度值,并將各條帶的光密度值以相應 GAPDH條帶的光密度值進行校正。光密度值比值統計分析結果顯示,3組大鼠 BDNF表達水平間差異有統計學意義 (F=10.834,P=0.001),模型組 BDNF的表達水平弱于對照組,差異有統計學意義 (P=0.000),而干預組 BDNF表達水平較模型組上調,與模型組比較差異有統計學意義 (P=0.019,見表 1)。

表 1 3組大鼠海馬 BDNF表達水平 (x±s)Table1 TheexpressionlevelsofBDNFweredigitizedbyusingScionimage softwareandstandardizedbyGAPDH

圖 1 大鼠海馬 BDNF的表達 (免疫印跡法)Figure1 TheexpressionofBDNFwasdeterminedbywesternblottinganalysis

3 討論

本研究通過免疫組化和免疫印跡的方法發現大鼠側腦室注射 Aβ25-35后能誘導 BDNF水平的下降,與 Christensen等[10-11]的研究結果相似,提示可能在 AD時產生的 Aβ能誘導BDNF水平的下降,從而加重了 AD神經元的損傷,使其記憶認知功能發生障礙。因此抑制 AD患者腦內 BDNF水平的下降可能對 AD有一定的改善作用。一些研究表明 Aβ25-35同時能降低 BDNF功能的發揮,如 Tong等[12]的研究表明較低劑量的 Aβ就能降低 BDNF的功能,具體機制為主要抑制了 BDNF發揮作用的兩條通路:有絲分裂蛋白激活酶 (ras-mitogenactivated protein kinase,MAPK)信號通路中的細胞外信號激酶 (extracellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2)信號通路和磷脂酰肌醇 3磷酸酶 (phosphatidylinositol3-kinase,PI-3-K/AKT)信號通路。故在 AD情況下,BDNF功能的下降可能也加重了學習認知障礙及神經損傷,其可能也是我們將來的一個研究方向。

本研究通過免疫組化及免疫印跡法顯示 DN能增加 AD模型大鼠腦內 BDNF的表達。一些研究顯示其對正常大鼠大腦內BDNF的影響較小[13]。故推測作用機制可能與其能抑制 Aβ的作用有關。與國外的一些結果類似,如 Leyhe等[14]的研究表明口服 DN組患者與服安慰劑者相比血清中 BDNF水平顯著增加,推測 DN通過增加 AD患者 BDNF的表達而發揮神經保護作用。Kotani等[15]的研究顯示 DN可增加 DG區磷酸化 cAMP反應元件結合蛋白 (Phosphorylation cAMPresponse elementbinding protein,pCREB)的陽性細胞數,故推測其可能激活cAMP反應元件而上調 BDNF的表達。其對其他調節元件的作用仍不清楚。另外其能否通過增加膽堿量而增加 BDNF的研究結果也很不一致,仍有待進一步研究。

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