旋覆代赭湯對(duì)混合性反流性食管炎模型大鼠CyclinD1表達(dá)的影響*

楊幼新，袁紅霞，馬 艷，韓順平，魏愛勤，潘 淼，徐軍娟

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)際教育學(xué)院，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；3.天津市南開區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，天津 300123）

反流性食管炎（RE）是由胃及十二指腸內(nèi)容物返流至食管所引起的食管黏膜的炎癥、糜爛及潰瘍等病變，是消化系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，且可引起多種并發(fā)癥。西醫(yī)對(duì)RE的治療是以抑酸為主，對(duì)膽汁和混合反流引起的食管黏膜損傷效果較差。筆者臨床中運(yùn)用旋覆代赭湯加減治療混合性反流性食管炎，收到較好的臨床療效。為探討其作用機(jī)制，實(shí)驗(yàn)觀察了旋覆代赭湯對(duì)混合性反流性食管炎大鼠的細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)Wistar大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，由衛(wèi)生部生物制品檢定所動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 旋覆代赭湯（旋覆花15 g，代赭石5 g，半夏 15 g，生曬參 10 g，炙甘草 15 g，生姜 20 g，大棗20 g），制成含生藥濃度為1 kg/L的水煎劑，分裝，置4℃冰箱備用。枸櫞酸莫沙必利分散片，成都大西南制藥股份有限公司產(chǎn)品，用蒸餾水配制成0.15 g/L的混懸液，分裝，置4℃冰箱備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 抗鼠CyclinD1單克隆抗體（克隆號(hào)：72-13G），為武漢博士德公司產(chǎn)品，SP系列檢測(cè)試劑盒及3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒，為美國(guó)ZYMED公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及造模 將80只健康Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為4組，即正常對(duì)照組、模型組、中藥治療組、西藥對(duì)照組，每組20只。除正常對(duì)照組外，其余各組參照王雯[1]等造模方法，通過改良的Clark[2]方法行“食管十二指腸端側(cè)吻合術(shù)”。手術(shù)方法為先予10%水合氯醛（3 mL/kg腹腔注射）麻醉大鼠，然后常規(guī)備皮并消毒后以上腹部正中切口進(jìn)腹。進(jìn)腹后將食管下段分離出神經(jīng)和血管，結(jié)扎賁門，用動(dòng)脈夾夾閉食管上段，然后切斷食管，縫合賁門并荷包包埋入胃中，保留全胃，距幽門口約2 cm處用4號(hào)手術(shù)縫線輕輕結(jié)扎十二指腸，然后在距幽門口約1 cm處縱行剪開十二指腸壁約0.5 cm，然后與食管下端全層間斷吻合4～6針，吻合完畢后，用注射器抽吸0.5 mL生理鹽水，分別從吻合口的食管端和十二指腸端向吻合口方向緩慢推注生理鹽水，觀察吻合口是否通暢或有無漏液，檢查完畢后腹腔內(nèi)注入硫酸慶大霉素2萬(wàn)IU關(guān)腹。術(shù)后予10%葡萄糖鹽水自由飲水，禁食48 h，此后常規(guī)喂養(yǎng)。術(shù)后1周，每日以10萬(wàn)IU/kg體質(zhì)量腹腔注射硫酸慶大霉素注射液。

2.2 給藥方法 于造模術(shù)后第7天開始，正常對(duì)照組、模型組以6.25 g/kg給予0.9%生理鹽水灌胃，中藥治療組以6.25 g/kg給予體質(zhì)量給予旋覆代赭湯水煎劑灌胃，西藥對(duì)照組以1.56 mg/kg給予莫沙必利混懸液，共給予21 d。

2.3 檢測(cè)方法

2.3.1 食管黏膜組織形態(tài)學(xué)檢測(cè) 自吻合口向咽喉部截取2cm左右食管，縱行剖開，生理鹽水清洗，10%甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)蘇木-伊紅（HE）染色，光鏡觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

2.3.2 免疫組化法檢測(cè)CyclinD1的表達(dá) 石蠟切片脫蠟，微波爐90～100℃抗原修復(fù)，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化酶活性，10%山羊血清封閉，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗、二抗及適當(dāng)比例的辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素，DAB顯色，觀察CyclinD1的表達(dá)。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，偏態(tài)分布資料的多組間比較使用秩和檢驗(yàn)，多組間陽(yáng)性率的比較采用χ2檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

3.1.1 組織形態(tài)學(xué)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 食管黏膜組織形態(tài)學(xué)觀察采用中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化內(nèi)鏡分會(huì)2004年12月頒布的RE診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，見表1。

表1 反流性食管炎黏膜病理分級(jí)Tab.1 Pathological grade of esopageal mucosa in reflux esophagitis

3.1.2 CyclinD1染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 以胞核內(nèi)見呈棕黃色或黃褐色顆粒，判為陽(yáng)性染色細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野,光鏡下按陽(yáng)性染色的細(xì)胞數(shù)分級(jí)。（-）：無陽(yáng)性細(xì)胞或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%。（+）：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%而＜25%。（++）：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥25%而＜50%。（+++）：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥50%。

3.2 組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 正常對(duì)照組鏡下可見黏膜層表面為非角化復(fù)層鱗狀上皮，其基底細(xì)胞層中有少許黑色素母細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞。模型組可見鱗狀上皮細(xì)胞水腫，基底層細(xì)胞增生，鱗狀上皮的黏膜固有層乳頭伸長(zhǎng)，上延至上皮表層下，固有層水腫，可見較多嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，部分可見黏膜糜爛或潰瘍形成，以上改變以食管下段為重。中藥治療組鱗狀上皮未見明顯細(xì)胞病變，黏膜較完整，未見糜爛、潰瘍等病變，固有膜菲薄，黏膜間質(zhì)僅見少許淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)。西藥對(duì)照組鱗狀上皮細(xì)胞略水腫，黏膜尚完整，未見明顯糜爛、潰瘍等病變，固有膜乳頭縮短，固有膜內(nèi)可見少許慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)。各組大鼠食管黏膜病理分級(jí)及積分情況。見表2。

表2 各組大鼠食管黏膜病理分級(jí)及積分Tab.2 Pathological grade and integral of each group rats with esophageal mucosa

3.3 CyclinD1的陽(yáng)性率表達(dá)情況 正常對(duì)照組大鼠食管黏膜的上皮基底層細(xì)胞可見部分細(xì)胞陽(yáng)性染色。模型組表達(dá)較強(qiáng)，而且更淺層上皮細(xì)胞亦有陽(yáng)性染色；中藥治療組及西藥對(duì)照組表達(dá)較模型組降低，陽(yáng)性的細(xì)胞主要分布于基底細(xì)胞層，中藥治療組降低更為明顯。4組之間CyclinD1陽(yáng)性染色的細(xì)胞數(shù)分級(jí)比較，差異有顯著性。4組之間CyclinD1陽(yáng)性率比較，模型組最高，正常對(duì)照組最低，兩者比較差異有顯著性。中藥治療組陽(yáng)性率顯著降低，與模型組相比差異有顯著性，與正常對(duì)照組及西藥對(duì)照組相比差異無顯著性。西藥對(duì)照組陽(yáng)性率亦較模型組有所降低，但差異無顯著性。由此可見旋覆代赭湯可明顯降低混合性反流性食管炎食管黏膜CyclinD1的表達(dá)，從而起到治療混合性反流性食管炎、預(yù)防復(fù)發(fā)及癌變的作用。見表3。

4 討論

中醫(yī)學(xué)無“反流性食管炎”這一病名，根據(jù)其癥狀表現(xiàn)可歸屬于中醫(yī)學(xué)中的吐酸、吞酸、反胃、嘈雜、嘔吐、噎膈等范疇。其病位主要在食管，屬脾絡(luò)胃，聯(lián)系肝膽，上可及咽喉，下連及脘腹。筆者根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為“脾胃虛弱，痰阻氣逆”為RE的基本病機(jī)。脾主運(yùn)化水濕，脾胃為氣機(jī)升降之樞紐，飲食失調(diào)、勞倦過度或情志不暢皆可損傷脾胃，脾胃氣虛，一則運(yùn)化水濕不利，蘊(yùn)濕生痰，壅滯脾胃；二則氣機(jī)升降失和，澀滯逆亂，夾痰上沖；或脾胃本虛，濕熱中阻，肝氣橫逆，胃失和降，濁氣上逆，痰氣郁阻；或憂思惱怒，五志過極，肝失疏泄，橫逆犯胃，致使脾胃之氣受損，升降失常，運(yùn)化失職，滋生痰濁，并隨虛氣上逆，出現(xiàn)反酸、燒心、嘔惡、吞酸、嘈雜、噯氣等癥。并且本病治療中易復(fù)發(fā)的重要原因就是重標(biāo)輕本，故益氣和胃治本要貫穿始終。

表3 各組大鼠食管黏膜CyclinD1的表達(dá)情況Tab.3 The expression of Cyclin D1 in esophageal mucosa in each group rats

旋覆代赭湯出自《傷寒論·辨太陽(yáng)病脈證并治下》第161條“傷寒發(fā)汗，若吐若下，解后心下痞硬，噫氣不除者，旋覆代赭湯主之”，全方由旋覆花、代赭石、半夏、生姜、人參、炙甘草、大棗7味藥組成，主治外邪雖經(jīng)汗、吐、下而解，但治不如法，中氣已傷，痰涎內(nèi)生，胃失和降，虛氣上逆以致心下痞硬，噫氣不除之證。后世醫(yī)家對(duì)此方的應(yīng)用發(fā)揮甚廣，各種病證中雖不見傷寒之表里證，亦未經(jīng)汗、吐、下治之，但見心下痞悶、脹痛、噫氣、噯氣、反胃、嘔吐、呃逆等證，辨證屬脾胃虛弱，痰濕內(nèi)生，痰阻氣逆，升降失常所致者，據(jù)“有是證用是藥”之法，多采用此經(jīng)方治療，療效顯著。

CyclinD1是一種在細(xì)胞周期中含量呈周期性變化的重要細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，能啟動(dòng)細(xì)胞周期并促進(jìn)細(xì)胞DNA的復(fù)制過程，有強(qiáng)烈的促細(xì)胞增殖作用，CyclinD1 從正常食管→RE→Barrett’s食管（BE）→食管腺癌（EA）的表達(dá)程度逐漸增強(qiáng)，與RE、BE及EA相關(guān)[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，旋覆代赭湯可明顯降低CyclinD1在食管黏膜中的表達(dá)，從而抑制食管黏膜上皮的過度增殖，起到治療RE、預(yù)防癌變的作用。RE在組織學(xué)水平治愈后，食管上皮細(xì)胞內(nèi)CyclinD1水平未完全恢復(fù)正常可能是其易復(fù)發(fā)的原因之一，而旋覆代赭湯可較好地使CyclinD1水平恢復(fù)至接近正常水平，可能是它預(yù)防RE復(fù)發(fā)及癌變的原因之一。

[1] 王 雯，李兆申，許國(guó)銘，等.不同方式建成3種反流性食管炎模型[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2000，25（3）：171－173.

[2] Clark GRB,Smyrk TC,Mirvish SS,et al.Effect of gastroduodenal juice anddietary fat on the development of Barrett's esophagus and esophageal neoplasia:An experimental rat model[J].Ann Surg Onco1,1994,1:252-254.

[3] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化內(nèi)鏡學(xué)分會(huì).反流性食管炎診斷及治療指南[J].中華消化內(nèi)鏡雜志,2004,21(4):221-222.

[4] 汪 濤，龔 均.大鼠混合反流模型中COX-2、PCNA、Cyclin D1的表達(dá)[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2005，26（5）：460－462.