植物葉形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)的簡易快捷觀測方法篩選

劉錦妍，李富恒，譚大海，岳明翠，黃福山

（東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

植物的形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)觀測有很多方法，觀測葉片表皮細胞及氣孔的方法有離析法[1-3]、印跡法[4-5]、刀刮法、撕剝法等；觀測葉片及葉柄橫切面的方法除石蠟切片法外，其他方法尚未見報道；葉片脈序的觀測有標本經(jīng)脈絡(luò)法等[6-7]。以上大多數(shù)方法都存在著成本高、耗時多、操作不便以致在教學中難以廣泛應(yīng)用、所用化學試劑對人體有害等缺點。筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，利用各種食用膠（明膠、瓊脂和卡拉膠等）的可塑性、透明性和膠粘性等特點來獲得植物材料的細胞痕跡，不僅可進行葉片表皮細胞的觀測，也可以進行葉片及葉柄橫切面細胞的性狀觀測。文章對利用各種食用膠獲得植物材料細胞痕跡的效果和操作方法進行了較為詳盡的研究，為今后深入的研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為番茄（Lycopersicun esculentum Mill.）、茄子（Solanum melongena L.）、抱子甘藍（Brassica oleracea L.var.gemmifera Zenker）、花椰菜（Brassica oleracea var.botrytis L.）等蔬菜作物的葉片和葉柄；食用類以及分析純類的各種食用膠（明膠、瓊脂和卡拉膠），其中食用明膠可根據(jù)粘度系數(shù)分成不同等級（12、16、20、30、40°等）。

1.2 方法

1.2.1 各種膠溶液的配制

稱取一定量的固體膠置于小燒杯中，加入蒸餾水配成一定濃度的溶液。水浴加熱，同時用玻璃棒慢慢攪拌，使其完全溶解形成膠液，加入少許染料使其顏色加深，將小燒杯靜置于40～60℃溫水的大燒杯中待用。

1.2.2 葉片表皮和橫切面細胞痕跡的制取

將制成的各種膠溶液平鋪在載玻片上，將葉片平鋪或立在凝固的膠溶液上面，室溫下放置一段時間后，當膠溶液完全凝固時用鑷子將葉片揭下來，就會留下清晰的葉片表皮和橫切面細胞痕跡。

1.2.3 葉柄橫切面細胞痕跡的制取

將制成的各種膠溶液平鋪在載玻片上，將一段葉柄立在凝固的膠溶液上面，室溫下放置一段時間后，當膠溶液完全凝固時用鑷子將葉柄揭下來，就會留下清晰的葉柄橫切面細胞痕跡。同時做徒手切片，比較兩種方法的效果。

1.2.4 葉片脫色方法

為了研究葉片輸導組織（維管束）的數(shù)量性狀，需要用有機溶液將葉片的綠色脫去且要保持葉片逐漸脫水而不變形。經(jīng)過多次試驗，我們摸索出了一套能達到上述要求的試驗方法。具體如下：選取所需葉片在沸水中煮5 min，使葉片軟化并排除葉片內(nèi)的空氣，每個葉片分別在梯度濃度為20%、50%、70%的乙醇溶液中各浸泡2 h，使葉片逐漸脫水而不變形。然后將脫水過的葉片放在由95%乙醇和100%丙酮組成的不同比例混合溶液中浸泡，共設(shè)計了五個脫色溶液配方：95%乙醇、75%乙醇+25%丙酮、50%乙醇+50%丙酮、25%乙醇+75%丙酮、100%丙酮。比較各種脫色溶液的脫色效果，直至完全脫色為止。

2 結(jié)果與分析

2.1 用瓊脂和卡拉膠制取細胞痕跡的效果

用食用類以及分析純的瓊脂和卡拉膠，每種類型的膠均進行不同濃度、不同染色劑處理，制取植物細胞痕跡的效果見表1、2。

表1 用不同處理的瓊脂凝膠制取細胞痕跡的效果Table 1 Effect of cell mark get from different agar gel treatment

表2 用不同處理的卡拉膠凝膠制取細胞痕跡的效果Table 2 Effect of cell mark get from different carrageenan gel treatment

由表1、2可知，瓊脂和卡拉膠不適合用來制備植物細胞痕跡，所制取的細胞痕跡不清晰。其原因是這兩種膠所制膠液透明度和柔韌度較差，難以滿足印跡法的要求。

2.2 用明膠制取細胞痕跡的效果

用不同等級（粘度系數(shù)分別為 12°、16°、20°、30°、40°）的食用類及分析純明膠，每種類型的明膠均進行不同濃度、不同染色劑處理，所制取的植物細胞痕跡效果見表3。由表3可知，粘度系數(shù)為16°和40°的食用類明膠及分析純明膠效果最好。

2.3 明膠溶液在載玻片上的適宜凝固時間

對不同濃度、各類型的明膠溶液在載玻片上放置不同的時間，然后放置植物材料制取細胞痕跡，在顯微鏡下觀察，找出能制取清晰細胞痕跡的各類型不同濃度明膠溶液的適宜凝固時間，結(jié)果見表4。

表3 用不同處理的明膠凝膠制取細胞痕跡的效果Table 3 Effect of cell mark get from different gelatin gel treatment

表4 不同濃度明膠的適宜凝固時間Table 4 Suitable solidifying time of different concentration of gelatin

表4中的適宜凝固時間即明膠溶液將要凝固的時間，也就是在膠液面上恰好能夠支撐植物材料的最短時間。從表4中可以看出，膠液濃度越大，最佳凝固時間越短；反之越長。在操作過程中分析純類明膠以15%左右的濃度為宜；食用類明膠以20%左右的濃度為宜，既有利于操作，又能取得較好的觀測效果（見圖版I）。

2.4 不同熔化溫度對分析純類明膠制取細胞痕跡效果的影響

由于分析純明膠類含雜質(zhì)少，制取細胞痕跡的效果最好，今后的應(yīng)用前景最廣。因此我們研究了不同熔化溫度對分析純類明膠制取細胞痕跡的效果影響，結(jié)果見表5。

從表5的試驗結(jié)果可以看出，除在100℃煮沸的條件下，其余溫度處理（40～90℃）對分析純類明膠制取細胞痕跡效果的影響差別很小，均可用于具體試驗操作過程中。但在試驗操作過程中，在允許的范圍內(nèi)應(yīng)使水浴的溫度盡可能高一些，可加速明膠的熔化速度，提高工作效率。

2.5 乙醇和丙酮及其混合溶液配制比例對葉片脫色效果的影響

葉綠素不溶于水，而溶解于乙醇和丙酮等有機溶液中。為了便于觀測、提高脫色效果我們設(shè)計了五個脫色溶液配方，脫色15 d，比較各種脫色溶液的脫色效果。結(jié)果表明，在所設(shè)計的五個葉片脫色溶液配方中，95%乙醇脫色效果最好；75%乙醇+25%丙酮和50%乙醇+50%丙酮兩個配方其次；25%乙醇+75%丙酮和100%丙酮兩個配方脫色效果最差。

圖版I 用明膠制取植物細胞痕跡的效果Plate I Effect of cell mark get from gelatin gel

表5 不同熔化溫度對分析純類明膠制取細胞痕跡效果的影響Table 5 Effect of different melting temperature on the cell mark get from analytically pure gelatin

2.6 葉柄橫切面解剖結(jié)構(gòu)的制取方法比較

用兩種方法制取葉柄橫切面的解剖結(jié)構(gòu)：①印跡法：與葉片表皮和橫切面細胞痕跡的制取方法相同，用分析純明膠處理；②徒手切片法：將欲觀察的葉柄部位用新的刀片迅速切割，放在番紅溶液中染色1～2 min后，取出制成臨時切片即可在顯微鏡下觀測葉柄維管束的數(shù)量性狀，并可進行顯微攝影。

結(jié)果表明，這兩種方法都適用于葉柄橫切面解剖結(jié)構(gòu)的制取，都能取得較好的制片效果。但相比之下徒手切片法操作更為簡便、觀測效果更好（見圖 1）。

圖1 徒手切片法效果(茄子葉柄,×40)Fig.1 Effect of bare-handed sectioning(Eggplant petiole,×40)

3 討論

3.1 用明膠溶液制取細胞痕跡的優(yōu)點

用明膠溶液制取細胞痕跡（印跡法）觀測植物葉的形態(tài)解剖學數(shù)量特性的方法具有操作簡便、節(jié)省時間、成本低廉、占用時間少、對人體無毒、需儀器設(shè)備少等特點，極大地簡化了植物解剖學方面的研究工作。本研究的相關(guān)內(nèi)容可用于中學生物課及大專院校生物類和農(nóng)學、園藝類專業(yè)的教學工作，為植物發(fā)育生理和植物解剖學的教學和科研工作提供了一個簡便、快速的新方法，豐富了植物學制片技術(shù)。如在全國范圍內(nèi)推廣，每年可節(jié)省大量教學經(jīng)費。

3.2 印跡法的應(yīng)用前景

印跡法是一種把細胞痕跡粘取在某種介質(zhì)上來觀測植物葉形態(tài)解剖學數(shù)量特性的方法，包括指甲油法、透明膠帶法、火棉膠法等。但過去這些方法只用于觀測葉片表皮結(jié)構(gòu)，應(yīng)用范圍有限。通過我們的試驗觀察，印跡法不僅適用于觀測葉片表皮結(jié)構(gòu)，也適用于葉片葉柄橫切面結(jié)構(gòu)的觀測，但要注意探索適用于不同作物葉片的具體操作方法。

3.3 葉片脈序的觀測

用于葉片輸導組織（維管束）的觀測，需將材料透明和漂白，使葉片呈白色并變?yōu)橥该髦苯语@示內(nèi)部的結(jié)構(gòu)。常用的是標本經(jīng)脈絡(luò)法，即先將葉片放入水中煮沸10～20 min，使葉片軟化并排除葉片內(nèi)空氣，再放入10%的NaOH溶液中透明，5%～10%的NaClO溶液漂白。不同作物葉片所需水煮時間、NaOH溶液透明和NaClO溶液漂白的濃度和處理時間均不相同，需探索適于不同作物葉片的具體操作方法。

此外，通過試驗觀察，95%乙醇處理也能達到同樣的目的。此外，葉片表皮觀測方法中的離析法不僅適用于分離上下表皮，而且也可用于研究葉片輸導組織（維管束）的觀測，制片效果非常理想。

4 結(jié)論

a.瓊脂和卡拉膠不適合用來制備植物細胞痕跡。各種類型的明膠都適用于用來制取植物細胞痕跡，其中粘度系數(shù)為16°和40°的食用類明膠及分析純明膠效果最好。

b.在操作過程中分析純類明膠以15%左右的濃度為宜，食用類明膠以20%左右的濃度為宜，既有利于操作，又能取得較好的植物形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)觀測效果。

c.95%乙醇用于葉片的脫色效果最好。但先要在梯度濃度為20%、50%、70%的乙醇溶液中各浸泡2 h，使葉片逐漸脫水，防止葉片脫水變形。

d.徒手切片法適用于葉柄橫切面解剖結(jié)構(gòu)的制取，操作簡便、觀測效果好。

e.40～90℃溫度條件下熔化分析純類明膠溶液均適用于細胞痕跡的制取，能得到好的效果。

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