趨化因子受體CCR5模擬肽生物學活性的初步研究

郭海萍 鄭雪燕

廣州醫學院病原生物學與免疫學研室（510182）

趨化因子受體CCR5（chemokine receptor 5）為細胞膜蛋白，它有7個跨膜結構，屬于G蛋白耦聯受體超家族，CC亞族趨化因MIP-1α、MIP-1β以及RANTES是CCR5的主要天然配體[1,2]。CCR5被認為是誘導Th1細胞向炎癥局部遷移的重要因子。目前CCR5已被證實對活化T細胞的游走起著非常重要的作用。CCR5的主要生物學功能是與相應的趨化因子結合來傳遞相應信號，使免疫活性細胞向趨化因子的來源部位募集、移動[3]。本研究通過對CCR5模擬短肽（HDTCSSHFPYSQ）對外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）的功能影響進行探討，以期發現相應趨化因子受體拮抗藥物的前體分子。

1 材料與方法

1.1 主要材料

MTS試劑盒（Cell T iter96?Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay）Promega公司產品。MIP-1α、MIP-1β及RANTES，英國Pepm Tech EC公司產品；RPML1640培養液和胎牛血清，Gibco公司；聚碳酸脂微孔濾膜（Polycarbonate membranes 10μm pore）和48孔標準趨化小室（Standard 48Well Chemotaxis Chamber）Neuro Probe Inc 公司。

1.2 CCR5模擬肽（HDTCSSHFPYSQ）的制備[4]

用噬菌體展示技術，以CCR5單克隆抗體作為篩選靶標，通過篩選噬菌體隨機12肽庫與CCR5單抗特異結合的肽段。經鑒定的30個陽性噬菌體克隆通過DNA測序，獲得CCR5單抗模擬抗原表位的10個多肽序列。獲得的核心序列HY-TC-SS-XX-P/FYS-X，與CCR5的一級序列ECL2具有一定的同源，選擇出現頻率最多（9次）的序列短肽（HDTCSSHFPYSQ），交由上海生工生物工程技術服務公司采用固相法合成模擬肽，合成肽用高效液相色譜HPLC純化，并經質譜確認，短肽（HDTCSSHFPYSQ）溶解于DMSO中配成100mg/mL，稀釋用pH 7.4的PBS溶液。

1.3 外周血單個核細胞（PBMCs）的分離

取健康人新鮮血液（購于廣州市金域體檢中心），用PBS稀釋血液1.5倍；將聚蔗糖-泛影葡胺淋巴細胞分離液放入離心管中，沿試管壁徐徐加入稀釋血液至分層液面上1cm處 ，以2000r/min離心20min，離心后，在分層液與血漿交界處用毛細管吸取細胞層，獲得單個核細胞（PBMCs）。37℃、5 %CO2、飽和濕度的條件下培養在含10%胎牛血清（FCS）、雙抗青霉素100μg/mL和鏈霉素100μg/mL的RPMI 1640培養液中。

1.4 MTS法檢測PBMCs增殖實驗[5]

新鮮分離的PBMCs制成單細胞懸液，用RPMI 1640培養液調節細胞濃度為4×104個/mL，加入PHA 5μg/mL，每孔按0.1mL細胞懸液的量入至96孔細胞培養板，每組為3個重復孔，空白對照孔不加細胞。常規培養24h；試驗組中每孔各加入0.05mL模擬肽樣品，設不加入樣品的陰性對照孔，培養48h；每孔各加入0.02mL MTS/PMS溶液，繼續培養1～4h，測定OD490值。抑制率（CI）= （對照組OD490-樣品組OD490）×100 %÷對照組OD490，計算值等于或超過30 %為抑制效果顯著。

1.5 檢測模擬肽對PBMCs對MIP-1α、RANTES及MIP-1β趨化活性的影響

48孔趨化小室上下室之間用Ⅳ型膠原包被的聚碳酸脂濾膜和乳膠隔墊隔開。下室每室加入29μL無血清RPML1640培養基，調整收獲的PBMCs懸液，濃度為每毫升1×106 細胞，加細胞懸液至上室，每室45μL，3個重復樣孔，孵育5h。取出微孔濾膜，刮膜器刮除干凈濾膜上面的細胞，下層粘附的穿膜細胞以瑞氏染液固定、染色15min。顯微鏡下隨機取上、下、左、右、中心5個視野，計數穿膜細胞數，取5個視野的總數表示單核細胞的趨化能力，平行實驗進行2次。

2 結 果

2.1 模擬肽對人外周血單核細胞增殖的影響

采用不同濃度的模擬肽作用于PBMCs，如表1所示，當短肽的濃度為20mg/L時，對PHA誘導的PBMCs增殖表現了明顯的抑制效應（P＜0.05），對PBMCs抑制率為30.2%；濃度為100mg/L時，對PBMCs抑制率達到了72.1%。

表1 MTS法檢測短肽對PBMCs生長的影響

2.2 模擬肽對人外周血單核細胞趨化的影響

用模擬肽0.5mg/mL作用于PBMCs 4h，取下游離的聚碳酸脂膜，在顯微鏡下計數穿膜的細胞數，模擬肽組穿膜細胞數為（20±6）個，與對照組（18±5）相比，穿膜細胞數相差無幾，說明短肽對PBMCs沒有趨化作用（P＞0.05），而與RANTES組比較（73±10）穿膜細胞數相差明顯（P＜0.05）；而預先經短肽處理2h的PBMCs （短肽+RANTES組） 其穿膜細胞數（26±9），則顯著少于RANTES組（P＜0.05），說明短肽能夠抑制PBMCs對RANTES的趨化效應。短肽預處理的短肽+ MIP-1α組和短肽+MIP-1β組分別與MIP-1α、MIP-1β組比較，結果發現該模擬肽不能影響MIP-1α和MIP-1β對外周血單核細胞的趨化作用（表2）。

表2 模擬肽對人外周血單核細胞趨化的影響

3 討 論

RANTES和MIP-1α、MIP-1β等CC類趨化因子則主要趨化單核細胞和淋巴細胞。趨化因子通過和相應受體的高親和結合產生生物學功能。由于G蛋白耦聯受體有很高的易操作性，被認為是進行免疫學治療阻斷趨化性細胞因子在許多疾病中所起作用的可靠靶點。本研究對CCR5 模擬短肽（HDTCSSHFPYSQ）進行活性分析，我們采用MTS/PMS比色分析法，測定了活化后的增殖，發現該模擬肽能抑制PHA對PMBCs的活化增殖作用，20mg/mL時，抑制率達到30.2%；且能抑制PBMCs對RANTES的趨化作用，而該模擬肽不能影響MIP-1α和MIP-1β對外周血單核細胞的趨化作用。推測趨化因子受體CCR5模擬短肽（HDTCSSHFPYSQ） 可作為CCR5的拮抗劑為進一步研究打下基礎。趨化性細胞因子受體選擇性拮抗劑的發展，為進一步了解免疫系統的生物學機制提供了有力工具，也為我們治療自身免疫性疾病、艾滋病等頑癥提供了一種新的思路。

[1] Atchison REJ,Gosling FS.Multiple extracellular elements ofCCR5 and HIV-1 entry: Dissociation from response to chemokines[J].Science,1996,274(5294): 1924-1926.

[2] Agrawal L,VanHorn AZ,Edward A,et al.Specific inhibition of HIV-1 coreceptor activity by synthetic peptides corresponding to the predicted extracellular loops of CCR5[J].Blood,2004,103(4):1211-1217.

[3] Wolkowicz1 R,Gina CJ.A random peptide library fused to CCR5 for selection of mimetopes expressed on the mammalian cell surface via retroviral vectors[J].J Biol Chem,2005,280(15): 15195-15201.

[4] Smith GP ,Scott JK.Libraries of peptides and proteins displays on filamentous phage[J].Methods Enzymol,1993,217(4):228-257.

[5] Beatrice M,Antonella M. The novel proapoptotic activity of nonnatural enantiomer of Lentiginosine[J].Glycobiology,2010,20(5):500-506.