微流控芯片在表面等離子體共振生物傳感器中的應用

駱亦奇

(斯坦福大學化學系 美國加利福尼亞94305)

今日化學

微流控芯片在表面等離子體共振生物傳感器中的應用

駱亦奇

(斯坦福大學化學系 美國加利福尼亞94305)

作為眾所周知的生物傳感器技術，表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)正在被越來越普遍地用于實現各種生物化學檢測方法，特別是用途廣泛的固相表面生物檢測(Solid－Phase Bioassay)。SPR對樣品進行非標記檢測，能夠用于測量生物化學反應全過程的反應動力學。為了提高SPR的檢測效率，通常將微流控技術(Microfluidics)與SPR相結合，即在SPR生物傳感器中使用微流控芯片(Microfluidic Chip)作為反應裝置。基于微型化帶來的優勢，使用微流控芯片作為反應裝置可以有效地縮短生物化學檢測方法的反應時間，并減少樣品消耗。微流控芯片還可以平行排布相同的結構單元，提高SPR生物傳感器的檢測通量。因此，使用微流控芯片作為反應裝置是SPR生物傳感器，特別是商品化的SPR生物傳感器的發展趨勢。

1 表面等離子體共振生物傳感器

表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)是當今應用最普遍的非標記光學生物傳感器(Label－Free Optical Biosensor)技術，在生物和化學工業特別是制藥工業中有很廣泛的應用。SPR不需要對被測物進行標記的優點使其可以測量生物活性分子在無修飾條件下的反應動力學。因此，SPR適用于高通量生物活性分子特別是小分子的篩選，微量未知物的分析，以及在線樣品檢測。由于其廣泛的應用價值，SPR生物傳感器(SPR Biosensor)的商品化已有近20年的歷史［1－3］。

SPR的工作原理是基于入射光激發的金屬/電介質界面的電子集團性共振現象。SPR生物傳感器中的電介質通常是含有生物活性分子的溶液。金(Au)是最普遍使用的金屬材料，這不僅是因為金具有適合于SPR用途的物理性質，也由于金具有穩定的化學性質且易于進行表面功能化。金的表面可以通過自組裝膜方法或者吸附方法固定生物活性分子，實現SPR生物傳感器的生物分子識別和捕捉功能。在SPR生物傳感器的測量裝置中，p型偏振入射光被高折射率棱鏡(Prism)耦合到金屬膜(Metal Film)與溶液的界面上，入射光的能量在金屬/溶液界面上被金屬自由電子組成的等離子體(Plasmon)吸收。高折射率棱鏡的作用是調節入射光的動量以達到與金屬/溶液界面的模式匹配，使入射光能夠共振激發金屬自由電子的集團性震蕩。等離子體的能量沿著金屬/溶液界面向附近傳播，以熱能的形式消散，所以反射光的能量小于入射光的能量。在垂直于金屬/溶液界面的方向上，等離子體的能量以消逝波(Evanescent Wave)的形式存在，通常這個消逝波的衰減距離在500nm以內。由于入射光和金屬/溶液界面的耦合條件與消逝波范圍內的溶液的折射率密切相關，可以用SPR測量金屬/溶液界面鄰近區域內的折射率。在實際應用中，通常用改變入射光角度的方法來改變到達金屬/溶液界面的入射光動量。當入射光角度達到共振角時，入射光與等離子體達到最佳耦合條件，金屬自由電子與入射光產生共振能量傳遞，入射光的能量幾乎完全轉換成等離子體的能量，反射光的能量達到最低。SPR光譜圖就是反射光與入射光的相對強度(Reflectivity)對于入射光角度作圖得到的曲線，從曲線的最低點可以讀出共振角的數值。共振角的數值取決于金屬/溶液界面鄰近區域內的折射率，通過記錄共振角隨時間的變化，可以實時測量該區域內的折射率變化。對于SPR生物傳感器來說，折射率變化由金屬/溶液界面鄰近區域內的生物化學反應引起，是衡量反應進程和反應動力學的有效指標。因為生物化學反應中的分子變化會引起反應所在區域的折射率變化，所以SPR生物傳感器不要求對被檢測的分子進行標記，有效地簡化了樣品制備過程。

SPR的測量裝置可以通過兩種帶有棱鏡的結構來實現，即按照棱鏡－溶液－金屬接觸順序的Otto結構和按照棱鏡－金屬－溶液接觸順序的Kretschmann結構。Otto結構中的溶液層厚度很小，給測量裝置的制造增加了難度。因此，現在大部分SPR生物傳感器尤其是商品化的SPR生物傳感器的測量裝置采用較易實現的Kretschmann結構。經典的采用Kretschmann結構的SPR生物傳感器的測量裝置如圖1所示。理想的SPR光譜圖如圖2所示，從圖2中SPR曲線的位置變化可以讀出金屬/溶液界面鄰近區域內進行的生物化學反應引起的SPR信號變化。在實時測量反應進程時，SPR信號既可以是共振角的變化，也可以是在固定的入射光角度下測量由于共振角變化引起的反射光與入射光的相對強度變化。在SPR生物傳感器的測量裝置中進行的生物化學反應，可以用SPR傳感器譜圖(Sensorgram)即SPR信號關于時間的圖譜來記錄。

圖1 采用K retschmann結構的SPR生物傳感器的測量裝置

圖2 理想的SPR光譜圖

生物化學檢測方法中的固相表面生物檢測(Solid－Phase Bioassay)是SPR生物傳感器的主要應用方向。固相表面生物檢測通過在固相表面上進行配體物(Ligand)分子與分析物(Analyte)分子的相互作用(Interaction)來實現。通常情況下這種相互作用是可逆的，包含了配體物分子與分析物分子的結合反應(Association)和解離反應(Dissociation)。固定在固相表面上的配體物分子可以識別并且結合與之接觸的液相中的分析物分子，將液相中的分子有選擇性地富集到固相表面上(圖1)。同時，由于這種相互作用是可逆的，當液相中的分析物分子數量下降時，在固相表面上已經結合的配體物分子與分析物分子可以進行解離反應，使得分析物分子重新回到液相中。對于測量范圍在金屬/溶液界面鄰近區域內的SPR來說，用于固相表面生物檢測可以有效地發揮其長處，特別是不需要對被檢測的分子進行標記的優點。因此，自從SPR生物傳感器的概念提出以來，大部分SPR生物傳感器，特別是商品化的SPR生物傳感器用于實現固相表面生物檢測。在學術界和工業界的應用中，SPR生物傳感器已經可以通過固相表面生物檢測來測量各種生物活性分子之間的親和力，包括大分子與大分子之間的親和力以及大分子與小分子之間的親和力［4－7］。

在用于實現固相表面生物檢測時，SPR生物傳感器的測量裝置需要執行3個主要反應步驟:①將可以選擇性結合分析物分子的配體物分子固定在金屬膜表面上。② 將流動的分析物溶液與金屬膜表面接觸，使得配體物分子與分析物分子在金屬膜表面上進行相互作用，包括結合反應和解離反應。分析物是SPR生物傳感器直接測量的物質，在常規的固相表面生物檢測中，分析物溶液等同于樣品溶液，分析物就是樣品中的被測物。這個步驟可以稱為結合步驟。③將流動的空白反應溶液(Running Buffer)與金屬膜表面接觸，使得在金屬膜表面上的配體物分子與分析物分子進行解離反應。這個步驟可以稱為解離步驟。在結合步驟中，開始時配體物分子與分析物分子只進行結合反應，隨著金屬膜表面上分析物分子數量增加，解離反應開始進行并且和結合反應同時存在，在反應時間充足的情況下，兩者的速率逐漸趨于相等，相互作用接近動態平衡狀態(Equilibrium)。在解離步驟中，由于空白反應溶液中沒有分析物分子，理論上在解離反應進行的同時不會有結合反應發生。因此通過解離步驟的結果可以準確地得到解離反應的動力學參數，然后綜合結合步驟和解離步驟的結果可以得到結合反應的動力學參數。理想的固相表面生物檢測的SPR傳感器譜圖如圖3所示，SPR信號的上升階段顯示了配體物分子與分析物分子的結合步驟，下降階段顯示了隨后的解離步驟。SPR信號的變化幅度顯示了金屬/溶液界面鄰近區域內總的分子數量變化，當配體物分子與分析物分子的相互作用達到平衡狀態時，SPR信號的變化幅度可以用來計算分析物分子在樣品溶液中的濃度。在主要反應步驟之外，測量裝置也需要執行一些輔助反應步驟，包括在固定配體物分子之前活化金屬膜表面和在固定配體物分子之后清洗金屬膜表面。由于主要反應步驟所需的配體物、分析物和輔助反應步驟所需的物質以溶液的形式進入SPR生物傳感器的測量裝置進行各種反應，這些溶液可以稱為用于固相表面生物檢測的反應溶液。

SPR生物傳感器技術在快速發展中。隨著SPR測量方法的漸趨成熟，如何提高測量裝置的效率成為革新的關鍵。SPR生物傳感器的主要應用方向是高通量快速檢測，微型化的測量裝置是提高檢測通量和速度的有效途徑，理由是:①通常SPR生物傳感器中的生物化學反應在流動中的溶液和功能化的金屬膜表面上進行，所以測量裝置的微型化可以提高傳質效率，以此加快反應速率，同時提高檢測速度［8－9］。②由于SPR的測量面積有限，測量裝置的微型化可以增加單位面積上的反應器單元，提高SPR生物傳感器的檢測通量(Throughput)。③測量裝置的微型化減少了檢測所需的樣品量，可以減少對微量樣品的稀釋程度，間接地改進SPR生物傳感器的最低檢測限(Limit of Detection)。所以，微型化的測量裝置符合SPR生物傳感器的要求并且從一開始就在其中應用。近年來，微流控技術(Microfluidics)的迅速發展提供了制造復雜的微流控芯片(Microfluidic Chip)的方法，推動了應用微流控芯片作為微型化的測量裝置的SPR生物傳感器的發展。

2 微流控技術和微流控芯片

微流控技術是研究設計制造微型化的實驗裝置(微流控芯片)并將其應用于以流體為載體的物理、化學、生物實驗的學科。自從20世紀90年代初被提出以來，微流控技術已經成功地將大量傳統的化學和生物實驗工具實現在微流控芯片上［9－11］，例如高效液相色譜、生物活性材料合成、聚合酶鏈式反應、固相萃取、蛋白質結晶、單分子光譜等。作為傳統實驗工具實現微型化的平臺，微流控芯片顯示出了以下優勢:高通量，快速，低樣品消耗，體積小，一次性使用，以及易于實現自動化。微流控芯片的優勢來自于微型化和液體在小尺度情況下的物理性質。微型化不僅縮小了實驗裝置的體積，減少了樣品消耗，還拉近了各個功能單元的距離，便于將不同的實驗工具在微流控芯片中連接起來實現自動化。同時，在微型通道里流動的液體，具有低Reynolds數流動的特點［12］。跟大尺度情況下相比，液體的流動受慣性力的影響下降，受黏滯力的影響上升。所以，液體在大部分微流控芯片中的流動類型屬于層流，具有穩定的流場，可以較為準確地進行控制。

微流控芯片由一個或幾個可供液體流動的微型通道網絡(Microchannel Network)構成。微流控芯片中的通道可以按照所具備的功能劃分為液體輸送管道，反應器，控制器等結構單元。反應器是微流控芯片中實現各種反應的結構單元，里面帶有功能化的表面或者參與反應的物質，例如用于SPR生物傳感器的微流控芯片中金屬膜所在的部分。控制器包括控制流體運動的閥門和各種推動流體運動的動力設備。微流控芯片中的閥門主要是微型薄膜閥［13］，動力部件包括微型蠕動泵(Peristaltic Pump)和電滲泵(Electroosmotic Pump)等［14］。

按照在垂直方向上的通道層數，可以把微流控芯片分為單層芯片和多層芯片。在單層芯片中，所有的通道排布于一個水平面上。單層芯片的優點是易于設計制造和穩定性高，缺點是無法安裝位于微流控芯片內部的控制器。因此液體在單層芯片中流動的方向完全由外接設備提供的條件例如電場和外壓力來控制，不易對特定位置的液流進行定點控制。在多層芯片中，通道排布于多個水平面上，在不同水平面上的通道之間既可以安裝彈性材料的薄膜用于實現薄膜閥和蠕動泵等控制器［13］，又可以制造垂直的通道將不同平面上的通道連接成三維通道網絡［15］。多層芯片的優點是可以在微流控芯片的內部使用控制器以實現復雜的功能，以及利用通道層數的優勢提高單位體積內結構單元的數量;缺點是制造成本較高。液體在多層芯片中流動的方向可以由控制器和外接設備提供的條件共同來控制，易于對特定位置的液流進行定點控制。對于SPR生物傳感器中的微流控芯片來說，也可以在垂直方向上將其分成流控部分(Fluidic Module)和基底部分(Substrate Module)。基底部分是帶有金屬膜的底板，用硬質材料制成，通常情況下金屬膜是金膜是金膜(Gold Film)，底板材料是玻璃。流控部分則是除了基底部分之外的微流控芯片，包含所有的通道，其中與基底部分接觸的通道是開放通道(Open Channel)，也就是有一個側面敞開的通道。微流控芯片由流控部分和基底部分上下疊合起來組成，流控部分中的開放通道可以與基底部分形成側面帶有金屬膜的封閉通道，SPR生物傳感器測量的生物化學反應在這些通道內的金屬膜表面上進行。

微流控芯片按照制造材料可以分為彈性材料芯片與非彈性材料芯片。彈性材料芯片主要以硅膠聚二甲基硅氧烷(PDMS)作為制造材料，主要原因為:①PDMS可以使用高復制度的多層軟光刻模板印刷法(Multilayer Soft Lithography)進行加工并且具有生物相容性［13，16－17］;②PDMS是制造薄膜閥的理想材料，以PDMS作為制造材料的微流控芯片可以大規模地使用微型薄膜閥以及在其基礎上構建的微型蠕動泵來實現對流體的控制。彈性材料芯片也可能會在彈性材料之外使用少量硬質材料，例如用于SPR測量的彈性材料芯片通常使用硬質材料制成的基底部分。另一方面，非彈性材料芯片通常以玻璃、石英、單晶硅、塑料等硬質材料作為主要制造材料，具有機械強度高的優點［18－20］。其中，玻璃和石英的表面電化學性質很穩定，是理想的用于毛細管電泳的微流控芯片材料［21］。單晶硅是制造集成電路的材料，以單晶硅為制造材料的微流控芯片可以與電子學技術結合以拓寬應用面［22］。以塑料為制造材料的微流控芯片可以用注塑加工來制造，價格便宜，適合工業化生產。非彈性材料芯片也可能會在硬質材料之外使用少量的彈性材料，例如具有液流控制功能的非彈性材料芯片經常使用PDMS薄膜構建微型薄膜閥［23］。因為彈性材料芯片和非彈性材料芯片各有優點，所以都有廣泛的應用，也都被應用于SPR生物傳感器中作為微型化的測量裝置。

在大部分情況下，微流控芯片在應用時與合適的外接設備連接，由外接設備提供光源，電源，光電信號檢測器，自動化機械裝置，計算機等工具輔助微流控芯片完成其功能。流體運動的推動力也可以由氣壓源和微量注射泵等外接設備來提供。外接設備的應用是由于這些設備不能或者沒有必要安裝在微流控芯片上。對于SPR生物傳感器來說，SPR光學系統不參與生物化學反應并且不需要微型化，因此可以作為外接設備與微流控芯片連接使用。通常情況下，商品化的SPR生物傳感器的外接設備具有強大的功能，加入了載物平臺和進樣器等自動化機械裝置以及計算機，用于實現SPR測量的自動化。因此，這種外接設備也可以稱為SPR生物傳感器的儀器系統。

3 微流控芯片在表面等離子體共振生物傳感器中的應用

在微流控技術的支持下，商品化的和實驗室報道的SPR生物傳感器已經廣泛使用微流控芯片作為微型化的測量裝置以提高其檢測效率。需要說明的是，大部分商品化的和一部分實驗室報道的SPR生物傳感器不是使用已經制成的微流控芯片，而是采用“實時組合”模式，在使用時將基底部分和流控部分組合成微流控芯片進行SPR測量。因為生物化學反應僅在基底部分的金屬膜表面上進行，所以只有基底部分是SPR測量的耗材，流控部分可以重復使用。這種“實時組合”式的微流控芯片既降低了SPR測量的成本又有利于實現SPR生物傳感器的自動化，所以被工業界廣泛采用。在商品化的SPR生物傳感器中，作為耗材的基底部分通常被稱為傳感器芯片(Sensor Chip)。如果不是從微流控芯片的角度而是從儀器結構的角度，也可以將商品化的SPR生物傳感器分為光學單元，液體處理單元和傳感器芯片，其中液體處理單元包括了微流控芯片的流控部分。傳感器芯片的金屬膜表面上可以進行化學修飾，其作用是協助生物化學反應在金屬膜表面上進行。根據化學修飾的不同可以把傳感器芯片分為各種類型，適用于不同條件下的固相表面生物檢測。

對于SPR生物傳感器的微流控芯片來說，設計的目標就是在實現這些反應步驟的同時提高SPR生物傳感器的檢測效率，包括SPR生物傳感器的檢測通量、精確度、最低檢測限和檢測速度等。

微流控芯片的微型化特點本身就可以改進SPR生物傳感器的最低檢測限和檢測速度。SPR生物傳感器的最低檢測限與樣品處理有關。當用于固相表面生物檢測的樣品量很有限的時候，如果用傳統的較大尺度的測量裝置，必須對樣品溶液進行稀釋以提供足夠的樣品溶液流過測量裝置與金屬膜表面接觸。如果使用微流控芯片，在反應時間和樣品溶液流速不變的條件下，可以降低樣品溶液的稀釋程度。這是由于微流控芯片中的溶液輸送通道的截面積很小(通常在0.001～0.01mm2范圍內)，樣品溶液的流量也就是消耗量降低了。因此，微流控芯片可以通過減少對樣品溶液的稀釋來間接地改進SPR生物傳感器的最低檢測限。

當SPR生物傳感器用于實現固相表面生物檢測的時候，在金屬/溶液界面上進行的結合反應和解離反應的反應動力學通常以Langmuir模型作為基礎推理得出。根據Langmuir吸附等溫式，反應動力學可以用方程(1)表示［24］。其中θ是分析物分子在金屬膜表面上的覆蓋率，即已經在金屬膜表面上與配體物分子結合的分析物分子密度SA和分析物分子在金屬膜表面上可能達到的最大密度之間的比值SA/(可以根據固定在金屬膜表面上的總配體物分子密度乘以結合反應的化學計量數得到)，也可以用尚未與分析物分子結合的配體物分子密度SL和總配體物分子密度之間的關系式(－SL)/表示。是分析物分子在樣品溶液中的濃度，是分析物分子在金屬/溶液界面鄰近區域內的濃度，在穩態時兩者之間的關系可以用方程(2)表示［8］。造成與不同的原因是在金屬/溶液界面上進行的結合反應屬于非均相反應，只有在界面鄰近區域內的分析物分子可以直接參與，反應器中其他的分析物分子必須通過傳質過程進入界面鄰近區域內才能參與結合反應。km是傳質速率常數，用于衡量分析物分子在樣品溶液中的傳質速率。k1和k2分別是分析物分子與配體物分子結合反應和解離反應的反應速率常數。由方程(1)和(2)可以得到在金屬膜表面上已經與分析物分子結合的配體物分子密度隨時間變化的動力學方程(3)，顯示出傳質速率常數km對反應速率的影響。當傳質速率常數km遠大于結合反應速率常數k1時，也就是在高傳質速率的情況下，反應速率與傳質動力學基本無關，僅由反應動力學決定。但是，當傳質速率常數km接近或者小于結合反應速率常數k1時，反應速率因為受到傳質過程的限制會低于高傳質速率的情況。由于傳質速率常數km與反應器高度的三分之一次方成反比［8］，微流控芯片中的反應器具備的微型化特點有利于提高傳質速率，減少傳質過程對反應速率的限制。所以，微流控芯片可以加快固相表面生物檢測中的結合反應和解離反應的反應速率，改進SPR生物傳感器的檢測速度。

微流控芯片的結構設計可以提高SPR生物傳感器的檢測通量和準確度。在SPR生物傳感器中，微流控芯片的反應器是底面帶有金屬膜的通道。與液體輸送管道相比，反應器通常具有不同的形狀，但是有時候反應器也可以是液體輸送管道的一部分。微流控芯片的設計重點在于如何排布液體輸送管道、反應器、控制器等結構單元，使得固相表面生物檢測所需的配體物分子和分析物分子被高效率地輸送到反應器，在金屬/溶液界面上進行相互作用。根據配體物分子和分析物分子被輸送到反應器的方式，微流控芯片的設計可以分為連續輸送型設計，交叉輸送型設計和液體動力輸送型設計等。

3.1 連續輸送型設計

在連續輸送型設計中，反應器處在一條液體輸送管道當中，反應溶液通過這條液體輸送管道流經反應器，配體物分子和分析物分子在反應器中的金屬膜表面上進行相互作用。與液體輸送管道相比，通常反應器是一個具有較大流動空間的通道。大部分連續輸送型設計把一定數量的相同的反應器平行排布于微流控芯片中，使其能夠同時進行多個結合反應，提高SPR生物傳感器的檢測通量。對于在這類微流控芯片中進行的固相表面生物檢測來說，由于到達每一個反應器的配體物和分析物都來自同一條液體輸送管道，如果不重復使用配體物或者分析物的話，相互作用的種類數NR與配體物的種類數NL及分析物的種類數NA之間應該是NR= NA=NL的關系。如果固相表面生物檢測的步驟包括對金屬膜表面上的配體物分子進行重活化(Regeneration)的步驟，分析物的種類數NA就可以不受限制，各種類數之間應該是NR=NA＞NL的關系。與其他設計相比，這種設計的優勢在于反應器之間沒有連接，反應溶液之間不易混合，保證了測量的準確度。具有代表性的連續輸送型設計的微流控芯片包括以下幾種。

1)美國Washington大學(Seattle)的研究人員報道的微流控芯片［25］。這種微流控芯片用一條液體輸送管道連接了反應器和多個具有分離和混合等樣品處理功能結構單元。因此，經過簡單過濾的唾液樣品可以直接進入微流控芯片，經過樣品處理之后進入反應器，其中的分析物分子在反應器中的金膜表面上與配體物分子進行相互作用。這種微流控芯片實現了多種功能的集成化，有利于實現自動化的SPR生物傳感器。

2)臺灣成功大學和清華大學的研究人員報道的微流控芯片［26］。這種微流控芯片帶有平行排布的液體輸送管道和反應器，金膜位于反應器的底面上。微流控芯片中的薄膜閥可以控制液體的流動。配體物分子和分析物分子經過同一條液體輸送管道進入每個反應器，在金膜表面上進行相互作用。除了用于反應器當中的金膜，這種微流控芯片還在靠近反應器的位置裝有用于加熱的金膜，可以有效地控制反應溫度，提高SPR測量的準確度。

3)美國Utah大學的研究人員報道的“實時組合”式的微流控芯片，由流控部分和帶有金膜的基底部分組成［27］。這種微流控芯片的流控部分帶有垂直于金膜表面的液體輸送管道，液流在其中的流動方向垂直于金膜表面，不同于大部分微流控芯片中液流平行于金屬膜表面的設計。為實現這種設計，液體在液體輸送管道的轉彎處通過側面的開口與金膜接觸，液體輸送管道的轉彎處加上開口處的金膜可以被認為是反應器。在這種微流控芯片中，金膜位于反應器的側面上，因此可以構建垂直于金膜表面的液體輸送管道。配體物分子和分析物分子經過同一條液體輸送管道進入每個反應器，在金膜表面進行相互作用。如圖4所示，這種微流控芯片的結構類似于微孔板(Microplate)，液體輸送管道的開口在側面形成一個二維陣列，與金膜接觸時可以形成一個反應器陣列。實現高通量的固相表面生物檢測。液體輸送管道垂直于金屬膜表面有利于分析物分子的傳質過程，使得分析物分子可以更快地進入金屬/溶液界面鄰近區域內，提高結合反應的反應速率。

4)通用電氣公司(GE)屬下的Biacore公司開發的Biacore 1000生物傳感器中的“實時組合”式的微流控芯片，由作為流控部分的IFC(Integrated Microfluidic Cartridge)和作為基底部分的帶有金膜的傳感器芯片組成［1］。這種微流控芯片的流控部分帶有平行排布的反應器，配體物分子和分析物分子經過同一條液體輸送管道進入每個反應器，在反應器中的金膜表面上進行相互作用。液體的流動方向由薄膜閥控制。液體輸送管道除了與反應器連接的部分，還包括定量環(Sample Loop)部分，因此可以在微流控芯片上準確地量取樣品溶液。

5)日本產業技術綜合研究所(AIST)的研究人員報道的微流控芯片［28］。這種微流控芯片的T形通道將兩個金膜串聯使用，在第一個金膜表面上進行配體物分子與分析物分子的結合反應，然后在第二個金膜表面上測量第一個金膜表面上的分析物分子催化的酶促反應進程。通過酶促反應進程可以間接地得到樣品溶液中的分析物分子濃度，從而推測出樣品溶液中的被測物分子濃度。由于SPR生物傳感器測量的分析物不是樣品中的被測物，這種檢測屬于間接型的固相表面生物檢測。在這種微流控芯片中，兩個金膜協同完成一種配體物和一種分析物的結合反應以及SPR測量。所以這種微流控芯片的設計可以算作對連續輸送型設計的一種改進。

3.2 交叉輸送型設計

在交叉輸送型設計中，反應器處在兩條液體輸送管道的交叉點，反應溶液分別通過這兩條液體輸送管道流經反應器，配體物分子和分析物分子在反應器中的金屬膜表面上進行相互作用。對于在這類微流控芯片中進行的固相表面生物檢測來說，由于到達每一個反應器的配體物和分析物分別來自兩條交叉的液體輸送管道，如果不重復使用配體物或者分析物的話，相互作用的種類數NR與配體物的種類數NL及分析物的種類數NA之間有NR=NA×NL的關系。與連續輸送型設計類似，如果固相表面生物檢測的步驟包括對金屬膜表面上的配體物分子進行重活化的步驟，分析物的種類數NA就可以不受限制，但是各種類數之間仍然是NR=NA×NL的關系。

交叉輸送型設計的微流控芯片適用于高通量的交叉篩選，就是將幾種配體物與幾種分析物一對一地進行相互作用以篩選出具有反應活性的分析物。這是因為在交叉輸送型設計中相互作用的種類數是配體物和分析物的種類數的乘積，既簡化了反應溶液的輸送又降低了反應溶液的消耗，對于交叉篩選具有最高的效率。具有代表性的交叉輸送型設計的微流控芯片包括以下幾種。

1)美國Wisconsin大學Madison分校的研究人員以及荷蘭Twente大學的研究人員報道的“實時組合”式的微流控芯片，由流控部分和帶有金膜的基底部分組成［29－31］。在使用過程中，流控部分在旋轉90度之前和之后兩次與基底部分組合，在水平方向上先后形成兩組交叉的通道，分別用于輸送配體物和分析物。配體物分子和分析物分子在位于兩組通道交叉點的金膜表面上進行相互作用，交叉點位置上的通道和金膜可以認為是微流控芯片的反應器。這種設計也可以允許先后使用兩種不同的流控部分輸送配體物和分析物，例如使用帶有多條平行通道的流控部分輸送配體物和帶有一條彎曲通道的流控部分輸送分析物，輸送分析物的通道與輸送配體物的通道來回交叉，使得每一種分析物分子與配體物分子的相互作用都在位于不同通道交叉點的金膜表面上重復進行，以此提高SPR檢測的精確度［30］。

2)美國Stanford大學研究人員報道的微流控芯片［32］。這種微流控芯片的流控部分使用彈性材料PDMS制造，制造方法遵循專門用于PDMS微流控芯片的多層軟光刻模板印刷法，就是將帶有開放通道的PDMS層加上基底部分按照順序上下疊合形成帶有多層通道的微流控芯片，如圖5A所示。基底部分是帶有圓形金膜的玻璃片。這種微流控芯片由兩層通道組成，兩層通道之間僅有幾十微米厚度的PDMS薄膜作為間隔，在兩層通道的交會處，這樣的PDMS薄膜可以在壓力作用下發生形變，作為薄膜閥使用。上層被稱為控制層(Control Layer)，因為上層通道專門用來制造微流控芯片中的薄膜閥，以便在外接設備提供的壓力下控制下層通道中液流的方向。下層被稱為流動層(Flow Layer)，因為參與固相表面生物檢測的反應溶液在下層通道中流動。流動層通道由兩組交叉的液體輸送管道陣列和位于交叉點的反應器組成，金膜位于反應器的底面上。配體物分子和分析物分子分別經過這兩組液體輸送管道進入反應器，在金膜表面上進行相互作用。這種微流控芯片可以同時在96個反應器中的金膜表面上進行配體物分子與分析物分子的相互作用，且每一種結合反應和解離反應都在4個相鄰的金膜表面上重復進行，以此提高SPR測量的精確度。在使用這種微流控芯片時，推動控制層中的薄膜閥和流動層中的液流所需的氣壓由外接設備來提供。圖5B展示了在使用過程中的微流控芯片以及微流控芯片的反應器區域在SPR生物傳感器的光學系統中的成像。

圖5 Stanford大學研究人員報道的微流控芯片

3)Bio－Rad公司開發的ProteOnTMXPR36生物傳感器中的“實時組合”式的微流控芯片，由作為流控部分的MCM(Multichannel Module)和作為基底部分的帶有金膜的傳感器芯片組成［33］。這種微流控芯片的流控部分帶有平行的開放通道，可以與傳感器芯片組合形成在一個側面上帶有金屬膜的封閉通道。流控部分固定在外接設備的機械平臺上，能夠自動旋轉和升降，因此可以與基底部分自動進行組合。在使用過程中，流控部分在旋轉90度之前和之后兩次與傳感器芯片進行組合，在同一個水平面上先后形成兩組互相垂直的通道，可以分別用于輸送配體物和分析物。配體物分子和分析物分子在位于兩組通道交叉點的金膜表面上進行相互作用，交叉點位置上的通道和金膜可以認為是微流控芯片的反應器。如圖6A所示，這種微流控芯片的流控部分帶有6條平行排布的開放通道，與傳感器芯片的兩次組合能夠產生36個陣列式排布的通道交叉點，所以可以同時在36個位于通道交叉點的金膜表面上進行配體物分子與分析物分子的相互作用。因為具有較高的檢測通量，ProteOn XPR36生物傳感器也稱為陣列式蛋白質相互作用分析系統(Protein Interaction Array System)。此外，在輸送分析物分子時，在交叉點兩邊沒有配體物分子的金膜與交叉點的金膜與同一股液流接觸且位置靠近，具備相近的反應條件，可以準確地提供SPR測量背景，提高SPR測量的準確度。相比于其他已報道的非自動控制的“實時組合”式的微流控芯片［29－31］，ProteOn XPR36生物傳感器中的微流控芯片具有兩個優勢:①流控部分與基底部分的組合可以自動進行，既節省了固相表面生物檢測所需的時間和工作量，又提高了多次使用時反應器位置的可重復性。②金膜表面上覆蓋的聚糖類分子簡化了固定配體物分子的反應步驟，避免了使用高濃度的有機溶劑對流控部分可能造成的損壞，因此固相表面生物檢測的反應步驟都可以在微流控芯片中實現。這些特點使得微流控芯片的使用過程便于機械化控制。如圖6B所示，微流控芯片可以在外接設備ProteOn XPR36儀器系統的輔助下實現ProteOn XPR36生物傳感器的全面自動化，得到穩定且重復性高的SPR傳感器譜圖。

圖6 Bio-Rad公司開發的ProteOn XPR36生物傳感器中的微流控芯片

將微陣列生物芯片(Microarray Biochip)和微流控芯片結合也可達到交叉輸送型設計的效果:①使用帶有金膜的載體，通過點樣技術將配體物固定在金膜表面上制成微陣列生物芯片。②將微陣列生物芯片作為基底部分與流控部分組合形成微流控芯片，金膜作為反應器的底面。這類微流控芯片通常采用“實時組合”模式，其中的反應器是一個具有較大流動空間的通道，也可稱為流通池(Flow Cell)。分析物分子通過液體輸送管道進入反應器，與配體物分子在金膜表面上進行相互作用。也就是說，配體物的輸送在微流控芯片之外完成。這種設計的優點是可以將上百種配體物固定在金膜表面上，且配體物的位置不受微流控芯片中通道位置的限制，適用于要測量多種配體物的固相表面生物檢測。但是，如果能夠對金膜表面上的配體物分子進行重活化，就可以測量多種分析物，達到交叉輸送型設計的效果。這種將微陣列生物芯片和微流控芯片結合的方法被用于Biacore公司開發的Flexchip，GenOptics公司開發的SPRi－Plex和SPRi－Lab+，Toyobo公司開發的MultiSPRinter，Graffinity Pharmaceuticals公司開發的Plasmon Imager，IBIS Technologies公司開發的 iSPR等商品化的 SPR生物傳感器［1］，以及Washington大學(Seattle)的研究人員以及Alberta大學的研究人員報道的SPR生物傳感器［34－35］。

3.3 流體動力輸送型設計

在微流控芯片的微型通道里，液體流動的類型以層流為主。因此，在沒有湍流的情況下，在微流控芯片中互相接觸的平行液流不會混合，液流之間僅通過分子擴散來傳質。根據這個特點，Washington大學(Seattle)的研究人員報道了用于測量小分子樣品的微流控芯片［36－37］。這種微流控芯片可以在平行液流的分界線附近利用分子擴散進行被測物分子與分析物分子的相互作用，間接地改變分析物分子與配體物分子在金膜表面上進行的結合反應和解離反應進程，以此來測量被測物分子濃度。由于SPR生物傳感器測量的分析物不是樣品中的被測物，這種檢測屬于間接型固相表面生物檢測。另一方面，在微流控芯片中也可以利用互相接觸的平行液流之間的作用力來改變液流的流動空間，這種利用流體力學原理輸送反應溶液的方式被稱為流體動力配置(Hydrodynamic Addressing)。Biacore公司的研究人員使用流體動力配置型設計開發了“實時組合”式的微流控芯片，由作為流控部分的IFC和作為基底部分的傳感器芯片組成［38］。這種類型的微流控芯片應用于Biacore S51和BiacoreA100生物傳感器中。在這種微流控芯片中的反應器有兩個進口和一個出口，固相表面生物檢測所需的反應溶液與空白溶液分別從兩個進口注入反應器，成為互相接觸的平行液流。由于互相接觸的平行液流會在有限容器中競爭流動空間，推動兩種溶液運動的壓強差決定了反應溶液在反應器中占有的流動空間，也決定了反應溶液在反應器底面上覆蓋的面積。因為金膜陣列位于反應器底面上，所以通過壓強差可以調節反應溶液覆蓋的金膜的數量，使得各種配體物分子與分析物分子的相互作用可以在不同的金膜表面上進行。Biacore A100生物傳感器中的微流控芯片擁有4個平行排布的分別帶有5個金膜的反應器，可以同時在20個金屬膜表面上進行配體物分子與分析物分子的相互作用。這種設計可以提高SPR測量的準確度，因為可以使用一個金膜為處于同一股液流之中的其他具備相近反應條件的金膜提供SPR測量背景。同時這種微流控芯片適合機械化控制，可以在外接設備BiacoreA100儀器系統的輔助下實現SPR生物傳感器的全面自動化。

4 總結

與傳統的用于固相表面生物檢測的實驗工具例如微孔板相比，SPR生物傳感器顯示出強大的優勢:①不需要對分析物進行標記的特點既節約了標記用的試劑和反應步驟，又使得實時測量固相表面生物檢測中的每一個反應步驟成為可能。②在固相表面生物檢測的反應步驟中，分析物溶液或者空白反應溶液在反應器中流動更新，可以在結合反應中補充分析物分子的消耗或者在解離反應中維持沒有分析物分子的溶液環境。與傳統的不更新分析物溶液的實驗工具相比，SPR生物傳感器既提高了反應速率又方便了反應動力學計算。當使用微流控芯片作為測量裝置時，SPR生物傳感器可以在一小時內完成傳統的實驗工具需數小時才能完成的固相表面生物檢測。隨著微流控技術的發展，微流控芯片的設計在持續地改進，各種微流控芯片可以從不同的方面提高SPR生物傳感器的檢測效率，包括檢測通量，精確度，最低檢測限和檢測速度等。對于SPR生物傳感器來說，應用微流控芯片作為微型化的測量裝置是將來的發展趨勢。以在學術界和工業界廣泛的應用前景作為推動力，這個研究領域將會繼續發展。

本文對于SPR原理的介紹得到了俞枋博士(師從SPR權威Wolfgang Knoll教授)的幫助和指正，在此表示誠摯的謝意。

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