氨基酸存在形式的分布及滴定法測定的可行性

張云孟潔

(同濟(jì)大學(xué)化學(xué)系 上海200092)

氨基酸存在形式的分布及滴定法測定的可行性

張云*孟潔

(同濟(jì)大學(xué)化學(xué)系 上海200092)

討論水溶液中各類氨基酸存在形式的分布及用傳統(tǒng)滴定分析法測定的可行性，用谷氨酸、精氨酸、組氨酸及絲氨酸驗證了討論結(jié)果。結(jié)論:酸性氨基酸可以用堿滴定;堿性氨基酸可以用酸滴定;中性氨基酸既無法用堿滴定，也無法用酸滴定。

羧酸分子中烴基的一個或幾個氫原子被氨基取代的化合物稱作氨基酸［1］。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)，也是蛋白質(zhì)水解的產(chǎn)物。氨基酸具有酸堿兩重性，其羧基可以提供質(zhì)子，氨基可以接受質(zhì)子，在水溶液中存在下述平衡:

氨基酸的上述3種存在形式分別稱作負(fù)離子、偶極離子及正離子，其中的偶極離子可以看作分子內(nèi)的羧基與氨基形成的內(nèi)鹽。在水溶液中，氨基酸主要以偶極離子的形式存在，而正離子和負(fù)離子的濃度都很低，且數(shù)量相等。此時，氨基酸水溶液的pH稱作等電點(diǎn)。若考慮酸堿性質(zhì)，可以將20種基本氨基酸分為酸性氨基酸、堿性氨基酸及中性氨基酸［1］。其中，谷氨酸和天冬氨酸屬于酸性氨基酸;精氨酸、賴氨酸及組氨酸屬于堿性氨基酸;除此之外的其余15種氨基酸屬于中性氨基酸。

氨基酸常用的測定方法是色譜法，如紙色譜、薄層色譜、離子交換色譜及高效液相色譜等［1］。此外，氨基酸的測定方法還有毛細(xì)管電泳法、紫外分光光度法、熒光法、電化學(xué)分析法及非水滴定法等。相對于上述方法，傳統(tǒng)滴定分析法具有操作方便，測定結(jié)果準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)。本文討論水溶液中各類氨基酸存在形式的分布及用傳統(tǒng)滴定分析法測定的可行性，并對討論結(jié)果進(jìn)行驗證。

1 酸性氨基酸的分布及測定的可行性

1.1 酸性氨基酸各種存在形式的分布

酸性氨基酸在水溶液中可以有4種存在形式，分別記作H3A+(正離子)、H2A(偶極離子)、HA－(負(fù)離子)及A2－。其中，正離子H3A+可以看作三元酸;偶極離子H2A既可以看作二元酸，也可以看作一元堿;負(fù)離子HA－既可以看作一元酸，也可以看作二元堿;A2－可以看作三元堿。以谷氨酸為例，在等電點(diǎn)pH=3.22時，其正離子H3A、偶極離子H2AE、負(fù)離子HA及A的分布系數(shù)分別為0.079、0.843、0.079及0。上述分布系數(shù)說明，在等電點(diǎn)時，谷氨酸雖然主要以偶極離子的形式存在(占84.3%)，但正離子和負(fù)離子仍占一定的比例(各占7.9%)。酸性氨基酸的α-羧基與其他位置的羧基中質(zhì)子的離解能力相近，其正離子的Ka1與Ka2相差不大，是引起這種現(xiàn)象的主要原因。

1.2 酸性氨基酸用堿滴定的可行性

將酸性氨基酸看作酸，討論其用堿滴定劑滴定的可行性。以谷氨酸為例，其正離子H3A(看作三元酸)的p Ka1、p Ka2及p Ka3分別為2.19、4.25及9.67，用堿滴定時，滴定曲線有一個突躍，滴定產(chǎn)物是負(fù)離子HA，滴定反應(yīng)是:

利用反應(yīng)式(1)，可以求出正離子H3A的濃度。谷氨酸的偶極離子H2AE(看作二元酸)的p Ka1和p Ka2分別為4.25和9.67，用堿滴定時，滴定曲線也有一個突躍，滴定產(chǎn)物也是負(fù)離子HA，滴定反應(yīng)是:

利用反應(yīng)式(2)，可以求出偶極離子H2AE的濃度。谷氨酸的負(fù)離子HA的p Ka為9.67，是一元極弱酸，用堿滴定時，滴定曲線沒有突躍，無法測出其濃度(有關(guān)酸堿直接滴定可行性的判據(jù)見文獻(xiàn)［2］)。

從上述討論可以得出結(jié)論:第一，谷氨酸的正離子H3A和偶極離子H2AE可以用堿滴定，而且滴定產(chǎn)物均是負(fù)離子HA;負(fù)離子HA無法用堿滴定。第二，由于谷氨酸的正離子H3A和偶極離子H2AE共存于溶液中，它們的滴定產(chǎn)物又均為負(fù)離子HA，反應(yīng)式(1)和(2)對應(yīng)的是同一個滴定終點(diǎn)。第三，根據(jù)反應(yīng)式(1)和(2)，有以下關(guān)系:

即在與OH－的反應(yīng)中，1個H3A相當(dāng)于2個H2AE。若以式(2)計量，對谷氨酸的偶極離子H2AE而言，測出的是其一倍濃度;對正離子H3A而言，測出的是其兩倍濃度;對谷氨酸的水溶液而言，測出的是其偶極離子H2AE的一倍濃度與正離子H3A的兩倍濃度之和。第四，在等電點(diǎn)時，谷氨酸的水溶液由偶極離子H2AE、正離子H3A及負(fù)離子HA3部分組成，而且正離子H3A的濃度又與負(fù)離子HA的濃度相等(各占7.9%)。因此，以式(2)計量，用堿滴定谷氨酸的水溶液，測出的既是偶極離子H2AE的一倍濃度與正離子H3A的兩倍濃度之和，又是偶極離子H2AE、正離子H3A及負(fù)離子HA濃度的總和，實際上也是谷氨酸的總濃度。

1.3 酸性氨基酸用酸滴定的可行性

將酸性氨基酸看作堿，討論其用酸滴定劑滴定的可行性。仍然以谷氨酸為例，其負(fù)離子HA的p Kb1和p Kb2分別為9.75和11.81，是二元極弱堿;偶極離子H2AE的p Kb為11.81，是一元極弱堿。用酸滴定谷氨酸的負(fù)離子HA或偶極離子H2AE時，它們的滴定曲線均沒有突躍，無法測出它們的濃度。雖然谷氨酸的A(看作三元堿)的p Kb1、p Kb2及p Kb3分別為4.33、9.75及11.81，用酸滴定時，滴定曲線有一個突躍，可以測出A的濃度，但在等電點(diǎn)時，在谷氨酸的水溶液中，A的分布系數(shù)為0，其濃度也為0，這種滴定沒有實際意義。

由于天冬氨酸的各級離解常數(shù)與谷氨酸相近，上述由谷氨酸得出的結(jié)論，同樣適用于天冬氨酸，實際上也適用于所有的酸性氨基酸。因此，按傳統(tǒng)滴定分析法的觀點(diǎn)，酸性氨基酸的水溶液可以用堿滴定劑滴定，但無法用酸滴定劑滴定。

2 堿性氨基酸的分布及測定的可行性

堿性氨基酸的分布及用傳統(tǒng)滴定分析法對其測定的可行性，與酸性氨基酸非常相似，用類似于對酸性氨基酸的討論方法，可以對堿性氨基酸進(jìn)行討論。堿性氨基酸在水溶液中也可以有4種存在形式，分別記作H3A2+、H2A+(正離子)、HA(偶極離子)及A－(負(fù)離子)。在等電點(diǎn)時，雖然堿性氨基酸的正離子和負(fù)離子各占一定的比例，但其偶極離子仍是主要存在形式。用酸滴定劑滴定堿性氨基酸的水溶液，滴定曲線有一個突躍，利用下述滴定反應(yīng):

可以求出該氨基酸的總濃度。由于堿性氨基酸的偶極離子是極弱酸，無法用堿滴定劑滴定。因此，按傳統(tǒng)滴定分析法的觀點(diǎn)，堿性氨基酸的水溶液可以用酸滴定劑滴定，但無法用堿滴定劑滴定。

3 中性氨基酸的分布及測定的可行性

3.1 中性氨基酸各種存在形式的分布

中性氨基酸在水溶液中可以有3種存在形式(酪氨酸和半胱氨酸除外)，分別記作H2A+(正離子)、HA(偶極離子)及A－(負(fù)離子)，其中正離子H2A+可以看作二元酸;偶極離子HA既可以看作一元酸，也可以看作一元堿;負(fù)離子A－可以看作二元堿。以絲氨酸為例，在等電點(diǎn)pH=5.68時，其正離子H2A、偶極離子HAS及負(fù)離子A的分布系數(shù)分別為0、1.00及0。上述分布系數(shù)說明，在水溶液中，絲氨酸雖然有3種存在形式，但在等電點(diǎn)時，其偶極離子HAS的形式占絕對多數(shù)，而正離子H2A+S和負(fù)離子A－S的形式接近于0。中性氨基酸的α-羧基與α-質(zhì)子化氨基中質(zhì)子的離解能力相差較大(即其正離子的Ka1與Ka2相差較大)，是引起這種現(xiàn)象的主要原因。在等電點(diǎn)時，其他中性氨基酸(酪氨酸和半胱氨酸除外)的各種存在形式的分布情況與絲氨酸相似。

3.2 中性氨基酸用堿或酸滴定的可行性

以絲氨酸為例，討論中性氨基酸用堿或酸滴定的可行性。將絲氨酸的偶極離子HAS看作酸，其p Ka為9.15，是一元極弱酸，用堿滴定時，滴定曲線沒有突躍，無法測出其濃度。將偶極離子HAS看作堿，其p Kb為11.79，是一元極弱堿，用酸滴定時，滴定曲線同樣沒有突躍，也無法測出其濃度。雖然絲氨酸的正離子H2A+S(看作二元酸)的p Ka1和p Ka2分別為2.21和9.15，可以用堿滴定;負(fù)離子AS(看作二元堿)的p Kb1和p Kb2分別為4.85和11.79，可以用酸滴定;但在等電點(diǎn)時，正離子H2A+S和負(fù)離子A－S的濃度均接近于0，這種滴定沒有實際意義。其他中性氨基酸(酪氨酸和半胱氨酸除外)的情況與絲氨酸相似。

此外，酪氨酸和半胱氨酸與其他中性氨基酸有所不同，在溶液中可以有4種存在形式，分別記作H3A+(正離子)、H2A(偶極離子)、HA－(負(fù)離子)及A2－。但由于這兩種酸的偶極離子H2A的p Ka1、p Ka2及p Kb均＞8，它們同樣無法用堿或酸滴定。

綜上所述，按傳統(tǒng)滴定分析法的觀點(diǎn)，中性氨基酸的水溶液既無法用堿滴定劑直接滴定，也無法用酸滴定劑直接滴定。

4 氨基酸測定可行性的驗證

4.1 驗證實驗

在100mL燒杯中，吸入10mL谷氨酸、精氨酸、組氨酸或絲氨酸溶液，加入5mL 1mol/L KNO3及35mL H2O，分別用0.01897mol/L NaOH或0.02163mol/L HCl自動電位滴定，記錄滴定曲線(平行實驗3次)。其中，氨基酸均為生化試劑，并經(jīng)105℃干燥至恒重。

4.2 驗證結(jié)果

第一，用NaOH溶液滴定谷氨酸溶液的滴定曲線有突躍，谷氨酸的測定誤差為0.5%(表1);用HCl溶液滴定谷氨酸溶液的滴定曲線沒有突躍，無法測出谷氨酸的濃度。第二，用HCl溶液滴定精氨酸或組氨酸溶液的滴定曲線有突躍，精氨酸和組氨酸的測定誤差分別為0.7%和－0.5%(表1);用NaOH溶液滴定精氨酸或組氨酸溶液的滴定曲線沒有突躍，無法測出精氨酸或組氨酸的濃度。第三，用NaOH或HCl溶液滴定絲氨酸溶液的滴定曲線均沒有突躍，無法測出絲氨酸的濃度。第四，驗證結(jié)果說明，用傳統(tǒng)滴定分析法對各類氨基酸的測定結(jié)果與上述理論討論所得出的結(jié)論一致。

表1 傳統(tǒng)滴定分析法對氨基酸測定可行性的驗證結(jié)果

［1］ 趙文恩.生物化學(xué).北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004

［2］ 張云.分析化學(xué).上海:同濟(jì)大學(xué)出版社，2003

* 通訊聯(lián)系人，E-mail:zyun@tongji.edu.cn