高效液相色譜法測定血府逐瘀片中赤芍所含芍藥苷的含量

2010-06-27 05:50:05劉立輝輝南縣人民醫院吉林輝南135100

長春中醫藥大學學報 2010年5期

劉立輝（輝南縣人民醫院，吉林輝南135100）

劉立輝
（輝南縣人民醫院，吉林輝南135100）

血府逐瘀片；高效液相色譜法；赤芍；芍藥苷；含量

血府逐瘀片是由赤芍、桃仁、當歸、川芎等11味中藥組成的復方制劑，具有活血祛瘀，行氣止痛之功效。主要用于瘀血內阻，頭痛或胸痛，內熱瞀悶，失眠多夢，心悸怔忡，急躁善怒等癥。收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準》中藥成方制劑第五冊59頁WS3 B－0928 91收載的“血府逐瘀膠囊”，現經劑型改革為“血府逐瘀片”，原藥品標準中沒有含量測定項，為了更好的控制產品內在質量，本實驗采用高效液相色譜法測定赤芍中芍藥苷的含量，該方法能有效地控制該制劑的質量。

1 方法

1.1 儀器與試藥島津SPD-10AVP高效液相色譜儀（日本）；芍藥苷對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，批號110736-200422，乙腈為色譜純，甲醇為優級純，其它試劑均為分析純。

1.2 色譜條件用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.05%磷酸溶液（16∶84）為流動相；檢測波長為230 nm。理論板數按芍藥苷峰計算，應不低于3 000。

1.3 對照品溶液的制備精密稱取芍藥苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL中含0.05 mg的溶液。

1.4 供試品溶液的制備取本品1 g，研細，精密稱定，精密加入70%乙醇溶液50 mL，超聲處理（250W，50 KHz）30min，放冷，濾過，精密量取續濾液25 mL，蒸至近干，殘渣加水30 mL溶解，加氯仿提取2次，每次25mL，棄去氯仿液，用水飽和正丁醇提取5次，每次25 mL，合并正丁醇提取液，置水浴上蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至25 mL量瓶中，加甲醇稀釋刻度，搖勻，即得。

2 方法學考察

2.1 理論板數的確定按上述方法測定，得到芍藥苷對照品及樣品的色譜圖。計算芍藥苷峰的理論板數（N）如下：N＝5.54×5.54×（10 241.834。此條件下，芍藥苷與其相鄰的峰分離完全，分離度符合規定，參考中國藥典2000年版一部赤芍項下有關規定，暫定其理論板數按芍藥苷峰計不得低于3 000。

2.2 測定波長的選擇經測定芍藥苷對照品甲醇溶液的紫外吸收光譜的最大吸收波長為230 nm，故選取230 nm為測定波長。

2.3 流動相的選擇試驗比較了（1）25%的甲醇溶液和（2）乙腈－0.05%磷酸溶液（16∶84）兩種流動相，結果表明，流動相（2）可獲得更好的分離，且保留時間較短，柱效高。

2.4 脫脂試劑的選擇試驗比較了乙醚、氯仿兩種試劑，從色譜圖上看效果都比較好，但氯仿比乙醚脫脂更徹底，故選定氯仿為脫脂試劑。同時將脫脂后的溶液蒸干，經甲醇5mL溶解殘渣，測其色譜圖無芍藥苷峰檢出，故可以認定脫脂過程中，測定組分基本無損失。

2.5 氯仿脫脂次數的考察試驗比較了脫脂次數1，2，3次，結果2次可以達較好的脫脂效果，故選取脫脂2次。

2.6 提取方法的考察試驗比較了（1）正文方法；（2）甲醇超聲提取30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水溶液，上D-101大孔吸附樹脂柱，水洗50 mL，氨試液2mL洗柱，水洗至中性，再用50%乙醇洗脫，收集洗脫液50mL，蒸干，定容于25mL。結果方法（1）和（2）測得的含量基本一致，但方法（1）色譜圖較（2）更清晰。故選定方法（1）為本法的測定方法。

2.7 標準曲線的制備取芍藥苷對照品10 mg，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別精密量取上述溶液1，2，5，8，9 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別取10μL注入液相色譜儀中，測定其峰面積積分值，以進樣量為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y＝698 923X－216 38，r＝0.999 9，表明芍藥苷進樣量在0.4～3.6μg范圍內與其峰面積有良好的線性關系，考察結果見表1。

進樣量／（μg／mL）0.04 0.08 0.2 0.32 0.36進樣量／μg 0.4 0.8 2.0 3.2 3.6峰面積／A 257 709.391 539 488.625 1 368 711.000 2 232 755.750 2 482 374.500

結果表明，芍藥苷在0.4～3.6μg的范圍內，進樣量與峰面積呈良好的線性關系。

2.8 陰性對照試驗取不含白芍的陰性對照品適量，依上述方法測定。結果，白芍陰性樣品的色譜圖在芍藥苷峰相應的保留時間附近無干擾峰出現。

2.9 穩定性試驗取本品3 g（批號040901），按正文擬定的含量測定方法測定，在0，2，6，10，16 h進樣，測定，結果見表2。

表2 穩定性試驗結果

如表2所示，在16 h內，供試品溶液中芍藥苷的含量基本穩定。

2.10 精密度試驗精密吸取上述供試品溶液10μL（批號040901），注入液相色譜儀，重復5次，按色譜峰面積值計，結果ˉx＝483 362，RSD＝0.21%，表明其峰面積基本一致，所用儀器精密性良好。

2.11 重現性試驗取同一供試品（批號040901），依正文方法獨立測定5次，結果ˉx＝1.62 mg／片，RSD＝0.98%，表明該方法重現性很好。

2.12 回收率試驗精密稱取同法測定已知含量的供試品（批號040901）（含量：1.62 mg／片）6份，每份1 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，再分別加入芍藥苷對照品溶液（1 mL溶液中含0.2 mg芍藥苷）5，5，15，15，25，25 mL至上述瓶中，精密稱定，置錐形瓶中，再分別精密加入70%乙醇溶液50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min（250W，50 KHz），取出，放冷，稱定重量，補足損失的70%乙醇量，濾過，精密量取續濾液25mL，蒸至近干，殘渣加水30 mL溶解，加氯仿提取兩次，每次25mL，棄去氯仿液，用水飽和正丁醇提取5次，每次25 mL，合并正丁醇提取液，置水浴上蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至25mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別精密吸取上述溶液和對照品溶液（精密稱取芍藥苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.05 mg的溶液，即得。）各10μL，注入液相色譜儀，測定，計算回收率。結見表3。