納洛酮對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦組織髓過氧化物酶的影響

李艷麗,程春鳳

(佳木斯大學附屬第二醫院神經內科,黑龍江 佳木斯 154002)

缺血性腦血管病是神經科常見疾病,缺血腦組織在血供恢復后會發生再灌注損傷,再灌注損傷中炎性細胞與炎性介質可對微循環及腦組織造成嚴重損傷。近年研究納洛酮在機體組織器官損傷、炎癥及休克等情況下有一定保護作用。本研究通過觀察納洛酮在腦缺血再灌注后對腦組織中髓過氧化物酶的影響來探討納洛酮的神經保護作用,現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 局灶性腦缺血動物模型

Wistar大鼠36只,體重320g左右,術前禁食過夜,自由飲水。大鼠隨機分為6組,每組各6只大鼠。分別進行 MPO檢測、紅四氮唑染色及腦組織含水量測定等三種檢測,每種檢測分為納洛酮治療組及生理鹽水對照組。大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)模型制作參照 koizumi線栓法。所有大鼠均栓塞右側大腦中動脈,栓線采用頭端涂聚乙烯醇的尼龍漁線。M CAO后2.5h,拔出栓線1cm長度,此時形成再灌注。供血從大腦前、后動脈流入大腦中動脈 ,再灌注前 5min,治療組腹腔注藥納洛酮1.5mg/kg,對照組腹腔注射生理鹽水1.5mL。術中及清醒前均給予頭燈 (100w)照射,保持肛溫37.0℃左右,室溫24～ 25℃。再灌注2.5h后按實驗的分組設計分別進行腦組織取材、染色及生化檢測。

1.2 模型完成及評分標準

參照 Longa及 Bederon的5分制評分方法進行評分,0分:無神經系統損傷癥狀;1分:不能完全伸展對側前爪;2分:向左側轉圈;3分:向對側傾倒;4分:不能自發行走,意識喪失。將0分、1分及4分大鼠去除,并補足各組設計所需大鼠數量。

1.3 MPO試劑盒操作過程

再灌注后迅速斷頭取腦,冰生理鹽水快速漂洗,徹底去除標本表面血液后,于冰盤上在右側半球(缺血側)視交叉處為中心,向后冠狀切取并精確稱重150mg腦組織,做 M PO檢測。MPO檢測按照試劑盒說明書操作要求進行,并按試劑盒提供的公式進行計算。

1.4 紅四氧唑染色及梗死體積測定

缺血再灌注后迅速斷頭取腦,將大腦半球放入冰箱冷凍至半硬狀后取出,距額極1毫米處以1.0mm為厚度冠狀切片。將切片放入 2%紅四氮唑(2、3、5-氯化三苯基四氯唑,TTC)生理鹽水溶液中避光37℃孵育0.5h,充分顯色后切片照相,并用計算機圖象分析系統進行切片梗死體積計算。

1.5 腦組織含水量測定

將待測大鼠右側大腦半球取出后,在扭力天平上精確稱濕重后置于 100℃烘箱內烘干 24h,再次稱重。腦組織含水量按(濕重-干重)/濕重計算,以%表示。

1.6 實驗藥物及主要試劑

鹽酸納洛酮:北京四環醫藥公司產品,M PO試劑盒;南京建成生物工程公司產品。TTC:上海華東師范大學化工廠產品。

1.7 數據處理

2 結果

2.1 模型評分

制作成功的大鼠中 4只出現傾倒,評分3分,32只向左轉圈 ,評分 2分。

2.2 各組 M PO含量檢測、腦組織含水量、梗死體積及應用納洛酮對其影響

見表1。

表1 兩組腦組織 M PO含量、水含量及梗死體積檢測 ±s,n=6)

表1 兩組腦組織 M PO含量、水含量及梗死體積檢測 ±s,n=6)

▲與對照組比較,P＜0.05;●與對照組比較,P＜0.05;■與對照組比較,P ＜0.05。

3 討論

缺血的腦組織在恢復血供后會繼續出現腦損傷,再灌注損傷是腦缺血損傷全過程中的一個重要部分。研究表明,腦缺血后白細胞浸潤主要位于梗死區周邊,再灌注后,則分布于整個缺血組織。白細胞浸潤于缺血腦組織可阻塞微血管,損害血腦屏障,釋放氧自由基和蛋白水解酶,直接損害神經細胞及誘導凋亡,使腦水腫及缺血加重。腦梗死患者缺血早期即有白細胞浸潤,其嚴重程度與病灶大小及預后有關,并且這種白細胞浸潤現象可持續到缺血后一個月。抑制白細胞浸潤可增加腦血流量,改善腦功能,減輕腦損害及縮小梗死灶。腦缺血時浸潤的白細胞成份主要是中性粒細胞,中性粒細胞的嗜苯胺蘭顆粒中含有 M PO,其含量恒定,約占細胞干重的5%,該酶有使過氧化氫還原的能力,利用這一特點可測定該酶活力,因此,測定出 MPO的活力可以定量的反映出浸入組織內的白細胞數量。本研究中發現應用納洛酮后缺血再灌注腦組織 MPO活性明顯降低,與對照組比較有顯著的統計學差異,說明缺血區腦組織浸潤的中性粒細胞數量減少,這將有利于改善腦缺血區微循環供血情況,同時也將減少中性粒細胞釋放生物活性物質造成的組織損傷。納洛酮治療組腦組織梗死體積及水腫均有明顯減少,可能此種抑制白細胞在腦組織浸潤的機制有關。研究證實腦缺血后缺血腦組織β-EP含量顯著增加[1]。機體損傷情況下中性粒細胞 CD18、CD54表達與β-EP升高呈正相關。納洛酮可以使休克大鼠中性粒細胞 CD18含量明顯降低[2],可以使大鼠腸缺血再灌注致肺損傷大鼠 M PO含量下降[3]。這提示納洛酮可以通過降低 β-EP水平而減輕炎性損傷 ,納洛酮減少 M PO活性的作用可能為其能降低 β-EP(β-內啡肽)有關。另外在體外實驗中發現納洛酮能明顯抑制中性粒細胞釋放超氧自由基陰離子,并呈劑量效應關系。這說明納洛酮還有可能直接作用于中性粒細胞,減少其釋放損傷因子而達到神經保護作用。納洛酮的作用機制較復雜,有可能減少缺血腦組織細胞凋亡[4,5],本實驗中觀察到納洛酮降低了缺血腦組織 M PO活性,并減少了梗死體積,提示納洛酮可能具有一定的神經保護作用,但納洛酮對缺血腦組織更進一步的作用機理還不十分清楚,值得進一步研究。

[1] 常高峰,劉興才,張基漠 .腦缺血再灌注時腦組織內啡肽的實驗研究-納洛酮治療遲發神經元損傷療效觀察 [J].中風與神經疾病雜志,1993,10(3):132-135

[2] 梅冰,庚舟,楊瑞和.創傷性休克大鼠中性粒細胞 CD18、糖皮質激素受體的變化及納洛酮治療作用的研究 [J].上海醫學,2000,23(1):19-22

[3] 何中乾,蔣健,陸一鳴.納洛酮在大鼠腸缺血再灌注致肺損傷中保護作用的初步研究 [J].中國急救醫學,2001,21(2):69-71

[4] 王雪紅,趙嘉訓.納洛酮對腦缺血 /再灌注損傷保護機制的研究進展 [J].國際麻醉學與復蘇雜志,2008,29(5):20-21

[5] 徐麗瑾,畢長柏,于哩哩.納洛酮對大鼠全腦缺血-再灌注損傷后神經細胞凋亡的影響 [J].腦與神經疾病雜志,2008,16(5):35-36