雷公藤多苷致體外幼鼠睪丸生精細胞凋亡的初步研究

劉立新,張羽男,張楠楠,袁 寰

(佳木斯大學藥學院,黑龍江 佳木斯 154007)

近年來,雄性動物生殖機能減退現象逐漸受到人們的重視,出現了諸如性欲減退、精液品質下降、受精能力降低的現象,人類更是受到了“ED(勃起功能障礙)”的困擾。當然,生殖功能下降是由多方面原因引起的,但藥物是其主要因素之一。雷公藤多苷是從植物雷公藤根提取精制而成的一種脂溶性成分混合物,是目前臨床上使用較多的中成藥制劑,其臨床應用范圍廣泛,幾乎涉及內科、外科、皮膚科、眼科、兒科等廣泛生命科學領域。但隨著雷公藤多苷應用范圍的擴大,其毒副作用也越來越受到人們關注,尤其在生殖毒性方面。動物實驗表明,雷公藤多苷可使雄性大鼠產生可逆性不育,有關雷公藤多苷生殖損害方面的報道多見集中在體內的研究,且僅限于成年鼠,而對于體外和有關幼鼠的研究鮮有報道,本試驗以體外培養的幼鼠睪丸生精細胞為研究對象,從細胞水平探討雷公藤多苷對幼鼠生殖細胞的毒性,為進一步揭示雷公藤多苷生殖毒性機制提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 主要材料

動物:15d齡 SD雄性大鼠,購自哈藥集團制藥總廠實驗動物中心。藥品:雷公藤多苷片(江蘇美通制藥有限公司);四噻唑藍(M TT)(Amresco產品);其他化學試劑均為分析純試劑。

1.2 主要儀器

二氧化碳培養箱(HPP-9162北京東聯哈爾儀器制造有限公司);970CRT熒光分光光度計(上海棱光精密科學儀器有限公司);318型酶標監測儀(上海科學儀器三廠)。

1.3 方法

1.3.1 幼鼠睪丸生精細胞懸液的制備

參照文獻方法[1]略有改進,取15d雄性幼鼠,頸椎脫臼法處死。無菌收集兩側睪丸用無菌 PBS(0.01M,pH7.3)洗滌,去包膜,將生精小管剪為約3～ 4mm小段,加入0.01M PBS 2mL,吹打成懸液,300目篩網過濾,1000r/min,離心 5min,棄上清液;沉淀物加入 2mL0.01M PBS清洗,吹打均勻后,以1000r/min,離心 5min,棄上清液;如此重復清洗 2次;用 2mL 70%冰乙醇將細胞沉淀吹打、制成懸液,備用。

1.3.2 MTT比色法

將分離的細胞接種于96孔培養板,待細胞長滿單層后,棄去培養液,加入含雷公藤多苷的培養液,使雷公藤多苷的終 濃度 分 別為 2.5μ g/L、 5μ g/L、 10 μg/L、20 μg/L、 40μ g/L同時設立不加雷公藤多苷的對照組和無細胞對照組,培養24h后,每孔加入 M TT溶液使其終濃度為0.5mg/mL。37℃恒溫孵育4h,吸去上清,每孔加入200 μL酸化異丙醇,震蕩 10min,使結晶物充分溶解,取100 μL溶液并轉移到一個新的96孔培養板,用酶標儀在570nm波長測定吸光值,記錄結果,計算細胞的存活率,并計算 IC50。

1.3.3 幼鼠睪丸生精細胞凋亡的檢測

1.3.3.1 吖啶橙熒光染色法[2]

細胞培養長成單層后,加入含雷公藤多苷的培養液,使雷 公 藤 多 苷 的 終 濃 度 分 別 為 2.5μ g/L、 5μ g/L、 10μg/L、20 μg/L,同時設對照組,培養箱中培養24h,按1.3.3方法收集細胞,調整細胞密度為 1× 106/mL,取95μL細胞懸液加入5μL吖啶橙熒光染色液(100 μg/mL,pH6.0),混勻后,將細胞懸液滴加到載玻片上,于熒光顯微鏡下觀察計數,每個樣品計數100個細胞,根據以下公式計算細胞凋亡指數和細胞壞死指數。

凋亡指數=凋亡細胞數÷(正常活細胞數+凋亡細胞數+壞死細胞數)×100%

1.3.3.2 TUNEL法

按試劑盒使用說明進行測定。

1.4 統計學處理

試驗數據采用 SPSS及 Excel軟件進行分析,所有值均以± s表示。

2 結果

2.1 M TT法檢測細胞活性

采用 MTT法對不同濃度雷公藤多苷作用的幼鼠生精細胞進行細胞活性檢測,結果見表1和圖1。由表1和圖1可見,隨著雷公藤多苷濃度的增加,細胞的相對存活率下降,而且濃度越大細胞的存活率越低,具有一定的劑量-效應關系,這表明雷公藤多苷對幼鼠生精細胞具有一定的毒性作用,能抑制細胞的活性,其 IC50為23.32±3.26。

表1 雷公藤多苷對鼠睪丸生精細胞活率影響的結果±s)

表1 雷公藤多苷對鼠睪丸生精細胞活率影響的結果±s)

圖1 MTT法測定雷公藤多苷對幼鼠生精細胞相對存活率的影響

2.2 雷公藤多苷致幼鼠生精細胞凋亡檢測

吖啶橙染色法:不同濃度雷公藤多苷作用的幼鼠生精細胞經吖啶橙染色后,顯微鏡下觀察,正常細胞核呈黃綠色均勻熒光。凋亡細胞呈黃綠色濃集在核膜內側,可見凋亡小體。由表2和圖2可以看出,隨著雷公藤多苷濃度的增加,凋亡指數逐漸增大,加雷公藤多苷藥物組與對照組比較差異均極顯著(P＜0.01)。

表2 雷公藤多苷對鼠睪丸生精細胞吖啶橙熒光染色的結果 ±s)

表2 雷公藤多苷對鼠睪丸生精細胞吖啶橙熒光染色的結果 ±s)

圖2 雷公藤多苷對幼鼠生精細胞凋亡指數的影響

TUN EL法:雷公藤多苷作用的細胞經染色后,顯微鏡下觀察,凋亡細胞的細胞核中有棕色顆粒,非凋亡細胞用蘇木素復染為藍紫色核。隨著雷公藤多苷濃度的增加,幼鼠生精細胞凋亡指數逐漸增加,加雷公藤多苷藥物組與對照組間比較差異均極顯著 (P＜0.01),見表2和圖2。

3 討論

雷公藤多苷是雷公藤根芯的提取物[3],具有廣泛的藥理作用,從治療風濕性疾病到系統性紅斑狼瘡、銀屑病、腎小球疾病、腫瘤,到應用于甲狀腺疾病、婦科疾病、哮喘等疾病,新近臨床上又應用于器官移植如腎移植取得了重大進展[4],但長期大量應用會對生殖系統產生損害作用,而導致不孕。盧清顯等[5]給大鼠每日喂服雷公藤總苷10mg/kg17周、13周和20mg/kg14周、10周,結果發現大鼠精子發生及曲細精管晚期精子細胞堿性核蛋白的替代和轉換均受到明顯抑制。張彬[6]等給 Wistar雄性大鼠每日灌服雷公藤多苷(10mg/kg)8周后,睪丸內的精子細胞及精子減少,曲細精管管腔緣出現病理形態的細胞及多核巨細胞。本試驗應用 MTT比色法測定了雷公藤多苷對幼鼠睪丸生精細胞活率的影響,又通過吖啶橙染色法和 TUNEL法測定了雷公藤多苷對幼鼠睪丸生精細胞凋亡情況的影響,結果表明,隨著雷公藤多苷濃度的增加,細胞活性逐漸降低,細胞凋亡指數逐漸升高,并呈劑量-效應關系,揭示了雷公藤多苷對幼鼠睪丸生精細胞具有明顯的毒性作用。

[1] 楊瑞.剛地弓形蟲致小鼠肇丸生精細胞損傷機制的探討 [D].山西醫科大學,2007,9

[2] 王心如.毒理學實驗方法與技術 [M].第4版.北京:人民衛生出版社,2007,141

[3] 周嘉陵,朱琦,楊曉凌,等.雷公藤制劑副作用的臨床觀察 [J].中國中西醫結合雜志,1999,19(2):77-79

[4] 黃真,毛慶秋.雷公藤多苷的臨床應用、不良反應及預防[J].藥品評價,2005,2(2):125

[5] 盧清顯,沈曉明,程凱,等.雷公藤總甙對大鼠生精作用及主要臟器的影響 [J].國科學院學報,1990,12(3):203-206

[6] 張彬.雷公藤多苷(GTW)抗雄性生育活動的研究 [J].中國現代醫學雜志,2002,12(4):16-17