骨髓基質干細胞誘導分化滑膜樣細胞移植預防屈肌腱粘連的實驗研究

利春葉 吳麗妮 朱肖奇 王愛琴 賈賽雄

(南方醫科大學附屬深圳寶安醫院 廣東深圳 518101)

1 動物實驗材料、方法

1.1 實驗動物

材料及儀器:新西蘭大白兔90只,雌雄不限,5～7周齡,體重2.5kg左右,其中3只用于提供BMCS以及關節滑液來源,其余用于研究防止肌腱粘連。

1.2 研究方法

MSCs的誘導分化:將MSCs移入含地塞米松1×10-7mol/L、關節滑液1×10-7mol/L、bFGF-23ng/mL、維生素C100mg/L的胎牛血清DMEM,誘導MSCs向滑膜細胞分化,通過離心、純化后鑒定(光鏡、透射電鏡以及免疫組化等鑒定)。然后培養擴增備用。

滑膜樣細胞移植:選用84只大白兔,每只兔的右后肢作為實驗組,左后肢為對照組。將誘導分化的細胞懸液移植入大白兔右后肢損傷的跟腱處,術后用管形石膏將下肢固定于膝關節屈曲15°,踝關節背伸l5°,足趾自然位。

檢測指標:術后l、2、4、8周取材。第1周每組各3只動物6條跟腱進行大體標本粘連等級評定、組織學觀察(包括光鏡和透射電鏡觀察);后3周每組各6只動物12條跟腱,隨機取6條跟腱進行生物力學測試,6條進行大體標本粘連等級評定及組織學觀察。

表1 肌腱粘連分布(等級資料的秩和檢驗)

表2 肌腱的斷裂載荷(單位:N)

2 結果

2.1 滑膜樣細胞的鑒定

BMSCs傳代培養初期可見大量懸浮細胞,48h后可見有散在紡錘形貼壁細胞,經多次半量換液后,未貼壁細胞逐漸被去除。4d后可見成簇、貼壁的紡錘形細胞逐漸增多,但仍存在混雜細胞。經多次傳代后,細胞逐漸純化,并且細胞初期多以集落形式增長,第6代后細胞呈形態均一的紡錘形,分布均勻。

在bFGF-2、關節滑液等誘導條件下,BMSCs逐漸向滑膜樣細胞形態分化。于4d后散在個別細胞逐漸呈梭型生長。7d后梭型細胞較前增多,細胞間較少見緊密聯接。10d時梭型細胞約占2/3。隨細胞數量增加而逐漸紊亂,無明確的方向性排列特征。14d時長滿培養皿底,細胞形態以梭形為主,兩極胞突細長,末端多與鄰近細胞連接并交織成網狀。網間散布有較多小星形或多邊形細胞,與梭形細胞緊密連接。

貼壁法純化后,擴增培養,將純化的梭型細胞用0.25%胰蛋白酶消化并吹打制成單細胞懸液,傳代培養。傳代細胞在48h內貼壁,并很快鋪展。

2.2 大體標本屈肌腱粘連等級評定

Hitchcock[1]粘連分度法評估結果顯示,隨著愈合的發展,對照組肌腱粘連逐漸加重,實驗組各時相粘連等級基本相當。同一時相點實驗組同對照組相比粘連明顯減輕(P＜0.05,見表1)。

2.3 跟腱生物力學測定

斷裂載荷測試結果顯示,實驗組與對照組比較,斷裂載荷有顯著差異(P＜0.05),但與正常屈肌腱的斷裂載荷比較,實驗組和對照組均明顯降低(P＜0.05,見表2)。

3 討論

3.1 骨髓基質干細胞向滑膜樣細胞的分化

骨髓基質干細胞是一種可多向分化的細胞,在特定條件下可分化為成骨細胞、軟骨細胞、心肌細胞和神經細胞等多種細胞。本研究表明,骨髓基質干細胞在關節滑液和FGF-2誘導下可以分化為滑膜樣細胞,其具有成纖維細胞樣滑膜細胞的組織學及超微結構特征,并且分化細胞免疫組化染色Vimentin陽性,CD68陰性。由于巨噬細胞樣滑膜細胞不具有增殖能力,可通過多次傳代去除巨噬細胞樣滑膜細胞而獲得較純的成纖維樣滑膜細胞[2]。這可能也是本實驗中獲得較純的成纖維樣滑膜細胞的原因。Vimentin(波形蛋白)是中胚層組織的特征性蛋白,主要存在于成纖維細胞和來自胚胎間充質的細胞。CD68是巨噬細胞的表面標志,我們用Vimentin及CD68單抗對培養的第三代滑膜細胞進行了鑒定,結果與上述文獻相符。

3.2 滑膜樣細胞移植預防肌腱粘連

早在1963年,Potenza[3]通過實驗研究認識到保持肌腱滑膜鞘的完整,有利于減輕肌腱愈合過程中的粘連。實驗組與對照組的跟腱粘連程度相比,實驗組粘連程度較小,而且從觀察時相開始到結束粘連程度相當,各時相點比較無統計學差異(P＞0.05)。此說明移植的細胞可有效防止肌腱粘連,并且可以促使滑膜形成及愈合,在光鏡及掃描電鏡下可以在肌腱周圍形成一薄層交織成網狀的滑膜樣細胞層。國內張正治等[4]將取自兔的趾腱鞘內的滑膜細胞經原代和傳代培養后,制成滑膜細胞懸液,再與自體無滑膜肌腱段聯合培養。經掃描電鏡觀察,培養后的肌腱表面變得光滑,經免疫組化染色vimemtin陽性,說明肌腱表面有滑膜細胞覆蓋,使之具有滑膜肌腱的形態學特征。這是與本實驗相吻合的。

3.3 滑膜樣細胞移植對肌腱強度的影響

雖然可以預防粘連,但肌腱達不到一定的抗張強度,也是萬萬不行的。滑膜樣細胞移植后,肌腱的斷裂載荷測試結果顯示,實驗組與對照組各時相數值比較,斷裂載荷有顯著差異,說明實驗組肌腱愈合后生物力學強度較高。但與正常屈肌腱的斷裂載荷比較,實驗組和對照組均明顯降低。雖然滑膜化肌腱抗張強度仍然達不到正常水平,但相比無滑膜肌腱有了很大提高。其中肌腱表面之滑膜在一定程度上增強了肌腱的抗張強度,而且滑膜分泌的滑液有營養作用,較之對照組促進了肌腱的更快愈合,也增強了肌腱的抗張強度。

[1]Hitchcock TF,Light TR,Bunch WH,et a1.The effect of immediate constrained digital motion on the strength of flexor tendon repairs in chickens[J].Hand Surg(Am),1987,12(4):590～595.

[2]Tomita T,Nakase T,Kanekom,et al.Expression of extracellular matrix met lop proteins inducer and enhancement of the preduction of matrix metal lop roteinases in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum,2002,46(2):373～378.

[3]Potenza AD.Critical evaluation of flexor-tendon healing and adhesion formation within artificial digital sheath[J].J Bone Joint Surg(Am),1963,45(6):1217～1233.

[4]張正治,劉正津,鐘世鎮,等.無滑膜肌腱滑膜化的組織工程學研究[J].生物醫學工程雜志，2001，18(1)：1～4.