d-δ-三烯生育酚對鼻咽癌細胞增殖的影響

曾 攀,黃嵐珍,范才文,易世江,肖勝軍,,Huanbiao Mo,向 秋,*

(1桂林醫學院科學實驗中心,桂林 541004;2桂林醫學院附屬醫院;3 Texas Woman′s University)

三烯生育酚是維生素 E的組成成分,目前發現有 α、β、γ和 δ三烯生育酚等四種成分。研究提示,三烯生育酚在保護神經、抗癌、降低膽固醇以及抗氧化等方面具有生物學活性[1]。α-三烯生育酚、γ-三烯生育酚和 δ-三烯生育酚有抑制腫瘤細胞生長、誘導腫瘤細胞凋亡等作用[2]。鼻咽癌是一種高侵襲轉移的惡性腫瘤,早期診斷困難,目前對其主要采用放療,但效果不理想,5 a生存率較低。近半年來,我們觀察了 d-δ-三烯生育酚對低分化 5-8F鼻咽癌細胞增殖的影響,探討 d-δ-三烯生育酚抗鼻咽癌的生物學活性。

1 材料與方法

1.1 材料 低分化 5-8F鼻咽癌細胞系(中南大學湘雅醫學院);d-δ-三烯生育酚(美國德克薩斯女子大學食品與營養研究所);小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);胰蛋白酶、MTT、DMSO(sigma公司);RPMI1604(Gibco公司);Hoechst33258(碧云天生物技術研究所);RPIM-1640培養基(含 10%小牛血清,100 U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 細胞接種于含 RPIM-1640培養基,37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。將培養細胞分為對照組和觀察組,實驗組設 40、50、60 μmol/L d-δ-三烯生育酚三個濃度。

1.2.2 d-δ-三烯生育酚干預及細胞形態學檢測將 5-8F細胞接種于 6孔板中,密度為 5×104/孔,每孔 2.0 ml。培養 24 h后更換培養基,觀察組加入 dδ-三烯生育酚(濃度分別為 40、50、60 μmol/L)。繼續培養 48 h,吸去培養基,每孔加入 4%多聚甲醛0.5～1.0 ml,室溫下固定 10 min。去固定液,用PBS洗 2次,每孔加入適量 Hoechst33258染料,染色10 min。PBS洗 2次后,加一滴抗熒光淬滅封片液封片,置熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況 。

1.2.3 d-δ-三烯生育酚干預及細胞增殖抑制率檢測 取對數生長期細胞,調整密度為 2.5×104/ml,接種于 96孔板,每孔 0.2 ml。培養 24 h后換培養基,分別加入 40、50、60 μmol/L d-δ-三烯生育酚,每個濃度設置 4個復孔,繼續培養 48 h后,每孔加入MTT(5 mg/ml)20μl,繼續培養 4 h。去上清,每孔加入 200μl DMSO,振蕩器上輕輕振蕩 5～10 min使結晶完全溶解,置 490 nm波長酶標儀上測定光密度值(OD值)。細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組平均 OD值 /對照組平均 OD值)×100%。

1.2.4 d-δ-三烯生育酚干預及細胞凋亡率與細胞周期檢測 取對數生長期 5-8F細胞接種于 100 ml的玻璃培養瓶中,待細胞長滿至 60%～70%后,換無血清培養基培養 24 h使細胞周期同步化。分別加入 40、50、60 μmol/L d-δ-三烯生育酚 ,每個濃度同時加入 10%血清培養基繼續培養 48 h后,收集細胞,以 70%預冷的乙醇 4℃固定過夜。離心洗滌后,調整細胞濃度至(1×105～1×106)/ml,流式細胞儀檢測細胞凋亡率,計算 S期細胞百分率。

1.3 統計學方法 采用 SPSS 13.0統計軟件。計量數據以xˉ±s表示。多組均數比較采用完全隨機的單因素(One-Way ANOVA)方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 d-δ-三烯生育酚干預后細胞生長和形態變化d-δ-三烯生育酚干預 48 h后,細胞生長受到明顯抑制,形態發生明顯改變:對照組貼壁細胞增多,輪廓清楚,細胞間接觸緊密;觀察組隨濃度增加,貼壁細胞逐漸減少,變圓、漂浮的死亡細胞增多。Hochest染色顯示,核熒光強染色、核固縮細胞比例隨d-δ-三烯生育酚的濃度增加而升高,細胞核或細胞質內出現致密濃染的顆粒狀或條塊狀熒光。

2.2 細胞增殖抑制率、凋亡率及 S期細胞百分率比較 見表 1。

表 1 兩組細胞抑制率、細胞凋亡率及 S期細胞百分率比較(%,ˉx±s)

3 討論

生育酚和三烯生育酚的主要區別在于前者的側鏈為飽和脂肪酸,后者的側鏈則是含有三個雙鍵的不飽和脂肪酸。盡管兩者在結構上有很大的相似性,但其生物學功能差異顯著。在抗腫瘤方面,三烯生育酚比生育酚具有更強的生物學活性[3]。據報道,口服 δ-三烯生育酚能有效抑制胰腺癌細胞生長[4]。Wada等[5]研究四種三烯生育酚亞型對人肝癌細胞 HepG2的抑制作用,結果表明,δ-生育三烯酚與 α-、β-和 γ-三烯生育酚相比,抑制肝癌細胞HepG2增殖的能力更強。Srivastava等[6]研究富含三烯生育酚的棕櫚油對正常人前列腺細胞和人前列腺癌細胞的影響,發現三烯生育酚可選擇性地抑制腫瘤細胞活性,而對正常細胞的影響較小。本研究結果顯示,δ-三烯生育酚對鼻咽癌細胞具有明顯的抑制作用,可將細胞阻滯于 S期,且呈劑量依賴性,60μmol/L的 δ-三烯生育酚對鼻咽癌 5-8F細胞的抑制率達 95%以上。

三烯生育酚誘導腫瘤細胞凋亡的可能機制:①促進雌激素 β受體向核定位轉移,激活雌激素作用因子,誘導 DNA斷裂和 Caspase-3活化,導致細胞凋亡[7,8]。②使凋亡因子 Caspase-8、Caspase-9和 Bax等表達升高[9]。本研究結果表明,δ-三烯生育酚有促進鼻咽癌凋亡的作用。

目前,δ-三烯生育酚抗鼻咽癌的報道不多,本研究結果證實,其是一種潛在的抗鼻咽癌的天然產物,其生物學活性和分子機制還有待于進一步闡明。

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