定量RT-PCR法檢測冠心病患者外周血15-脂氧合酶基因表達水平的研究

侍杏華,周建平

(1.鹽城衛生職業技術學院,江蘇鹽城224005;2.江蘇省鹽城市第一人民醫院 224005)

15-脂氧合酶(15-Lipoxygenase,15-LOX,OMIM:152392)在人體內可以氧化脂肪酸(如花生四烯酸、亞油酸),過度表達后可直接氧化低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL),改變LDL生物學活性,誘導動脈粥樣硬化[1]。大量動物實驗顯示,15-LOX的活性增高或過表達可加速早期動脈粥樣癥的發生。在人和兔的動脈粥樣硬化斑塊中均發現具有酶活性的15-LOX蛋白表達[2-3],而抑制15-LOX及其產物的活性或敲除15-LOX基因可顯著延緩動脈粥樣癥的發生與發展[4-5]。研究表明,血清白介素-4(IL-4)可誘導人外周血單核細胞高表達15-LOX[6]。動脈粥樣硬化患者外周血單核細胞15-LOX的表達量在動脈粥樣硬化中具有重要的病理生理作用。目前,15-LOX基因在冠心病患者外周血單核細胞的表達變化少見相關報道。本研究利用實時熒光定量RT-PCR技術,建立一種靈敏、特異和準確的檢測15-LOX基因表達的方法,并從分子水平探討外周血單核細胞的15-LOX mRNA表達差異在冠狀動脈粥樣硬化發生發展中的意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 在2008年9～12月本院心內科住院患者中,共篩選60例經臨床診斷為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的患者。其診斷根據典型的臨床表現、心肌酶學、心電圖等指標,符合世界衛生組織(WHO)關于冠心病的診斷標準。其中急性心肌梗死(AMI)組32例;穩定性心絞痛(SA)組 15例;不穩定性心絞痛(UA)組13例。健康對照組為40例健康體檢者,無既往冠心病史,血常規、血脂和肝腎功能指標均正常,無其他自身免疫性疾病及感染性疾病表現。

1.2 試劑與儀器 Trizol購自Invitrogen公司;反轉錄用M-MLV、RNasin和Buffer購自Promega公司;DEPC購自Sigma公司;無水乙醇、dNTPs和隨機引物等購自上海生工生物工程技術公司;膠回收試劑盒、pMD18-T質粒、PCR用 Taq酶、dNTPs、Buffer、MgCl2、SYBRREXSCRIPTTMReal-time 試劑盒等購自大連寶生物技術有限公司;瓊脂糖、EB購自BBI公司;DNA Marker購自MBI公司;引物和探針由上海博亞生物技術公司合成;細胞總RNA抽提試劑盒購自華舜生物試劑公司;胰蛋白胨、酵母提取物購自Oxoid公司。DH5α大腸桿菌為本實驗室保存的菌株。Line-GeneⅡ熒光定量PCR儀為杭州博日公司產品。

1.3 標準品質粒的構建 構建重組質粒pMD18-T-15-LOX作為定量模板,以15-LOX基因序列(GenBank登錄號:NM-001140.3)為模板,PCR擴增引物如下,上游引物:5′-CCA ACC ACC AAG GAT GCA A-3′, 下 游 引 物:5′-TCG TAG GGC ATG TCC AGC TT-3′。產物長度 251bp。反應體系:反轉錄產物 5μ L、標準品上下游引物(5μ M)各 3μ L,Buffer 3μ L,MgCl23μL,dNTP 2.4μ L,Taq 酶 0.3μ L,DEPC 水 10.3μ L;循環參數:95℃預變性 5min、95℃40s、58℃40s、72℃40s,循環 35次;72℃延伸5min。PCR產物經電泳初步鑒定。PCR產物電泳檢測后,膠回收,定量,然后克隆到 T載體,轉化入 DH5α,用IPTG/X-gal/Amp平板(Amp 濃度 60μ g/mL,50μ L 24mg/mL的IPTG和 60μ L 20mg/mL X-gal鋪板)篩選出陽性克隆,含Amp 60μ g/mL 的LB肉湯增菌,提取質粒,經酶切、PCR、DNA測序進行鑒定。

1.4 熒光定量PCR檢測體系的建立 根據基因庫中人15-LOX(NM-001140.3)和β-actin(28251)的 mRNA 序列,利用Beacon Designer 2.1軟件設計特異性的引物和探針,序列如下,上游引物:5′-TCG GGC CC TGA GCC TAA G-3′,下游引物:5′-CAT TCC GGA TCT CAA T TT CCT T-3′,探 針:FAM-T TC AGG GAG GAG CTG GCT GCC C-TAM RA,擴增產物片段長 82bp。β-actin 上游引物:5′-AGA TCA GAT CAT TGC TCC TCC TG-3′,下游引物:5′-CAT TTG CGG TGG ACG ATG GA-3′,探針:FAM-CGG ACT CGT CAT ACT CCT GCT TGC TG-TAM RA,擴增片段長145bp。選用 20μ L反應體系 :模板 5 μ L,P2(5 μ M)2 μ L,探 針(5 μ M)2 μ L,10 ×Buffer 2 μ L,2.5 mM dNTP 1.6 μ L,25 mM MgCl2 1 μ L,Taq酶(5u/μ L)0.2μL,H2O 6.2μ L;循環參數為 95℃ 5min 預變性,95℃0s,58℃25s,并采集熒光信號,共40個循環。

1.5 分離白細胞和制備細胞總RNA 所有入選者空腹采集靜脈血3mL,以1∶9的枸櫞酸鈉抗凝,加入等體積生理鹽水稀釋后,以2mL的淋巴細胞分離液按密度梯度離心法分離單核細胞。收集細胞沉淀,提取細胞總RNA,操作嚴格按照上海華舜生物試劑公司的細胞總RNA抽提試劑盒的說明書進行。分別通過1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度儀,檢測所得總RNA的質量和濃度。

1.6 配制標準陽性模板及繪制標準曲線 陽性克隆大腸桿菌在含Amp的LB肉湯增菌,提取質粒,取10μ L質粒用雙蒸水稀釋100倍,260nm,280nm比色,純度=A260/A280,濃度=A260×50×2×100×10-6×6.02×1023/(2971×324.5×2)copy/mL,根據質粒濃度,進行10倍梯度稀釋得8個濃度的標準品:107～101copy/μ L,分別每個濃度標準品作模板進行熒光定量反應,所得熒光曲線經軟件處理得標準曲線。

1.7 定量PCR檢測15-LOX的表達 按前述方法,將從患者和健康對照者白細胞抽提得到的總RNA全部反轉錄cDNA;然后按上述反應體系和反應條件將15-LOX和β-actin的陽性模板、患者和健康對照者的cDNA同時在定量PCR儀上進行擴增。反應結束后,電腦軟件將樣本的擴增曲線與標準曲線對比,并結合內參自動計算出各樣本的15-LOX基因表達的拷貝數。

2 結 果

2.1 PCR產物及重組質粒的鑒定 PCR產物理論長度為251bp,重組質粒經PstrⅠ、BamHⅠ雙酶切,理論酶切產物251bp,產物電泳后,條帶位置與理論上相符(圖1)。質粒送上海生工生物工程公司測序,測序結果與理論相符合。

圖1 重組質粒pMD-T-15-LOX的酶切及PCR鑒定電泳圖

2.2 定量PCR標準曲線的建立和內對照的設定 5個濃度的標準品(105-101copies/μ L)分別做熒光定量 PCR,得到的熒光曲線和標準曲線,相關系數為0.994(圖2)。為了減少由于細胞數差異和抽提RNA得率差異所引起的誤差,作者以持家基因β-actin作為內參照,β-actin基因的Ct值在 18～20的認為是有效標本,確保RNA反轉錄效率的一致性。

圖2 定量RT-PCR法檢測冠心病患者外周血15-LOX mRNA的熒光曲線與標準曲線

2.3 15-LOX mRNA在各組患者和健康對照者中的表達量所有標本均重復檢測兩次取均值,根據標準曲線計算機軟件自動獲取基因拷貝數濃度。各組15-LOX mRNA含量的定量檢測結果:AMI組〔(9.45±4.24)×105copy/mL〕、SA 組〔(4.86±3.75)×105copy/mL〕和UA 組〔(4.43±2.51)×105copy/mL〕15-LOX mRNA的表達量均顯著高于健康對照組〔(4.79±1.76)×104copy/mL〕(P＜0.05),而 AM I組、SA 組、UA 組之間的15-LOX mRNA表達量差異無統計學意義(P＞0.05)。

3 討 論

近年來得以廣泛應用的實時聚合酶鏈反應(real-time PCR)技術,因其信號檢測與PCR擴增同管、同步進行,屬于均相測定,故可減少污染,操作簡化,并且可自動化完成擴增及定量檢測。此外,real-time PCR還具有高通量、快速、精確定量以及實時監控反應進程等優點。故在其發明后的極短時間內,real-time PCR被廣泛應用到臨床分子診斷中[7]。

動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的病理基礎,其發病的分子機制至今尚未闡明,包括天然免疫和獲得性免疫在內的免疫機制在動脈粥樣硬化中的作用不容忽視[8]。在人類動脈粥樣硬化病變的各個時期也可觀察到淋巴細胞的存在,動脈粥樣硬化的機制之一是對氧化型LDL的自身免疫反應,淋巴細胞起重要作用[9]。15-LOX是脂氧合酶同工酶的一種,是機體催化花生四烯酸生成活性分子從而影響細胞信號轉導及代謝的關鍵酶,能夠誘導單核巨噬細胞中低密度脂蛋白的氧化,與動脈粥樣硬化早期血管損傷的修復炎癥反應及病理變化密切相關。因此,對15-LOX的表達調控研究在動脈粥樣硬化病因研究中有重要意義。15-LOX由定位于17p13.3的ALOX15基因編碼,含14個外顯子。國外曾有對ALOX15基因的2個單核苷酸多態性(SNP),即啟動子 c.-292位置的C＞T和c.1693C＞T(導致T560M氨基酸置換突變)的研究報道,提示ALOX15基因的生理學表達并不加快動脈粥樣硬化的發生,反而具有保護作用[10-12]。2009年,Hersberger等[13]針對518例心肌梗死患者和2 111例正常對照的大規模研究再次表明,上述2個功能性SNP位點與心肌梗死無關。而本研究采用定量PCR技術,檢測了60例漢族冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者及40例健康對照者外周血單核細胞上15-LOX mRNA的表達量。實驗結果表明患者組15-LOX mRNA的表達量均顯著高于健康對照組,而AMI組、SA組和 UA組之間的TLR4 mRNA表達量差異無統計學意義,提示15-LOX mRNA表達量在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者中有明顯上調,與動脈粥樣硬化的發生、發展可能存在一定的相關性。本研究下一步將進一步擴大樣本量,就15-LOX對動脈粥樣硬化患者的影響及其作用機制進行更深入的探討,為本病的分子診斷、藥物基因組學和基因治療等提供一定的理論依據。

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