氨茶堿、地塞米松對哮喘患者CD4+CD25+T調節細胞抑制功能的影響

張 妍,周文英,鄔偉明,黃 瑾△

(中山大學附屬第五醫院:1.呼吸科;2.中心實驗室,廣東珠海519000)

支氣管哮喘的發病與Th1/Th2系統失衡和 Th2細胞優勢分化相關,Th2型細胞因子IL-4可促進IgE的產生,IL-5可促進嗜酸性粒細胞的分化,IL-13可促進黏液的分泌和誘導氣道高反應性,從而介導哮喘氣道炎癥和氣道重塑過程。而Th1型細胞因子IFN-γ可抑制Th2型細胞的分化,被認為對過敏性疾病的發生具有保護作用。但Th1/Th2理論并不能充分解釋哮喘的發病機制[1]。自CD4+CD25+T調節細胞被首次報道以來,這類具有獨特免疫調節作用的專職調節細胞在自身免疫性疾病、移植排斥反應和過敏性疾病中的作用越來越受到重視。糖皮質激素類藥物和茶堿類藥物均是目前治療哮喘的一線用藥。激素類能有效控制氣道炎癥,茶堿類能抑制磷酸二酯酶活性,使細胞內cAMP增高從而引起支氣管擴張,但有證據顯示茶堿在其血藥濃度尚未達到影響支氣管平滑肌張力時就可發揮免疫調節和抗炎作用[2]。本實驗觀察哮喘患者及健康對照者CD4+CD25+T調節細胞對Th1/Th2型細胞因子產生的影響及激素類藥物地塞米松和小劑量氨茶堿對 CD4+CD25+T調節細胞作用的影響,旨在進一步探討哮喘患者CD4+CD25+T調節細胞的作用是否存在缺陷及不同藥物對其作用的影響,從而為哮喘的更有效控制提供依據。

1 臨床資料

1.1 研究對象 哮喘患者12例,男 7例,女 5例,平均年齡(33±11)歲。按《支氣管哮喘防治指南》[3]明確診斷,為本院門診及住院患者,均未使用茶堿類藥物、糖皮質激素類藥物或停藥2周以上。健康成年人9例,平均年齡(28±12)歲,男5例,女4例,為本院健康志愿者。

1.2 主要試劑與儀器 完全培養基包括RPM I-1640培養基(Gibco公司)、10%小牛血清(杭州四季清公司)、2mmol/L L-谷氨酰胺、10mmol/L HEPES、100u/mL青霉素、100u/mL鏈霉素等。氨茶堿、地塞米松購自Sigma公司。淋巴細胞分離液(1.073g/mL)購自上海恒信化學試劑有限公司。鼠抗人CD8純化抗體、鼠抗人CD25-純化抗體、羊抗鼠IgG免疫磁珠以及熒光抗體包括鼠抗人CD4-FITC、鼠抗人CD25-PE及鼠抗人IgG1-FITC/IgG1-PE購自美國BD Pharmingen公司。抗CD3純化抗體、抗CD28純化抗體購自北京晶美科技有限公司。人IL-5、IL-13、IFN-γELISA試劑盒購自深圳達科為生物科技有限公司。FACS Calibur型流式細胞儀購自美國Becton Dickinson公司。酶標儀購自INSTRUMENTS.INC公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 外周血CD4+CD25+T調節細胞的分離[4]采集哮喘患者及健康對照者外周靜脈血30mL,分離、洗滌外周血單核細胞,并用尼龍棉柱分離出T淋巴細胞。按2μ g/107個細胞加入鼠抗人CD8純化抗體,37℃下孵育30min,1 000r/min離心5min,棄上清液中未結合的抗體,按 120μ g/107個細胞加入羊抗鼠IgG免疫磁珠,在37℃下反應30min,間隔 10min輕輕晃動反應管。接著加入3mL完全培養基重懸細胞,用磁分離器分離8min,收集未被免疫磁珠結合的細胞懸液至另一干凈管中,所得即為CD4+T淋巴細胞。取分離后的CD4+T淋巴細胞,按前分離方法及添加比例依次加入鼠抗人CD25純化抗體、羊抗鼠IgG免疫磁珠,用磁分離器分離,收集未被磁珠結合的細胞即為CD4+CD25-T淋巴細胞,被磁珠結合的細胞即為CD4+CD25+T調節細胞。取105個CD4+CD25+T調節細胞加入抗CD4-FITC及抗CD25-PE標記,用流式細胞儀檢測[4]雙陽性細胞的純度為81.3%～89.8%,可用于下一步實驗。

1.3.2 CD4+CD25+T調節細胞與CD4+CD25-T淋巴細胞的體外培養及藥物干預 以1640完全培養基調整細胞濃度,置96孔板培養,設CD4+CD25+T調節細胞組(2.5×104/孔)、CD4+CD25-T淋巴細胞組(105/孔)及CD4+CD25+T調節細胞聯合CD4+CD25-T覆水難收細胞組(2.5×104+105/孔),第3組又分為氨茶堿干預組(5mg/L)、地塞米松干預組(10-5mol/L)及空白對照組,各組均設3個復孔,每孔另外添加抗CD3純化抗體(10μ g/mL)及抗 CD28純化抗體(10μ g/mL),調整每孔體積為200μ L。為避免添加藥物對CD4+CD25-T淋巴細胞產生影響,參照Dao Nguyen和 Robinson[5]的處理方法,先予氨茶堿、地塞米松及平衡液預處理CD4+CD25+T調節細胞,置 37℃、5%CO2培養箱內 12h后,以 1640完全培養基離心洗滌CD4+CD25+T調節細胞以去除干預藥物對后續培養的影響。細胞接種后培養72h,取培養上清液100μL,-20℃保存,用于細胞因子的檢測。

1.3.3 IL-5、IL-13及IFN-γ水平的檢測 嚴格按照試劑盒說明書操作,測吸光度(A450nm)值,通過標準曲線計算培養上清液中各細胞因子的含量,結果以pg/mL表示。

1.4 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件分析,數據以表示,采用獨立樣本t檢驗及配對樣本t檢驗,以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 分離得的CD4+CD25+T調節細胞純度檢測 CD4+CD25+T調節細胞純度為81.3%～89.8%,檢測結果見圖1。

圖1 流式細胞儀檢測分離得的CD4+CD25+T調節細胞純度

2.2 哮喘患者細胞培養上清液中 IFN-γ、IL-5、IL-13水平測定 詳見表1。哮喘患者CD4+CD25+T調節細胞能有效抑制CD4+CD25-T淋巴細胞生成 IFN-γ、IL-5(P＜0.01),對IL-13的合成無顯著抑制作用;采用地塞米松預處理CD4+CD25+T調節細胞后,CD4+CD25+T調節細胞抑制IL-5、IL-13生成能力增強(P＜0.01);采用氨茶堿預處理后,CD4+CD25+T調節細胞抑制IL-5生成的能力增強(P＜0.01)。

表1 哮喘患者細胞培養上清液中IFN-γ、IL-5、IL-13水平測定(n=12pg/mL)

表1 哮喘患者細胞培養上清液中IFN-γ、IL-5、IL-13水平測定(n=12pg/mL)

組別 IFN-γ IL-5 IL-13 CD4+CD25+T調節細胞組 1.84±0.71 1.54±0.59 1.60±0.88 CD4+CD25-T淋巴細胞組 45.76±8.20 67.13±9.89 85.55±10.58空白對照組 35.03±5.64 59.20±9.30 81.58±6.18地塞米松干預組 34.25±9.26 38.08±8.01 75.48±6.03氨茶堿干預組 37.53±7.51 38.63±8.28 79.94±6.28

表2 健康對照者細胞培養上清液中IFN-γ、IL-5、IL-13水平測定(n=9,pg/mL)

表2 健康對照者細胞培養上清液中IFN-γ、IL-5、IL-13水平測定(n=9,pg/mL)

與空白組比較,*:P＜0.05,▲:P＜0.01;CD4+CD25+T細胞組未參與比較。

組別 IFN-γ IL-5 IL-13 CD4+CD25+T調節細胞組 1.64±0.41 1.46±0.60 1.30±0.48 CD4+CD25-T淋巴細胞組 48.00±7.96▲ 53.81±6.92▲ 79.90±6.21▲空白對照組 35.31±3.77 42.71±5.17 55.01±10.75地塞米松干預組 31.01±5.24* 29.96±2.81▲ 45.71±6.27▲氨茶堿干預組 38.96±5.32 31.78±4.39▲ 46.79±6.64*

2.3 健康對照者細胞培養上清液中IFN-γ、IL-5、IL-13水平測定 詳見表2。健康對照者CD4+CD25+T調節細胞能有效抑制CD4+CD25-T淋巴細胞生成 IFN-γ、IL-5及IL-13(P＜0.01);采用地塞米松預處理后,CD4+CD25+T調節細胞抑制IFN-γ(P＜0.05)、IL-5(P＜0.01)及 IL-13(P＜0.01)生成的能力顯著增強;采用氨茶堿預處理后,CD4+CD25+T調節細胞抑制IL-5(P＜0.01)、IL-13(P＜0.05)生成的能力亦顯著增強。

3 討 論

目前大量研究提示CD4+CD25+T調節細胞在哮喘的發病機制中起著重要的作用。Kearley等[6]證實:CD4+CD25+T調節細胞可以抑制氣道嗜酸性粒細胞的聚集及Th2型細胞因子的產生。Ling等[7]研究發現,枯草熱患者體內分離的CD4+CD25+T調節細胞抑制細胞增殖的能力在非花粉傳授季節是降低的,在花粉傳授季節更低。而Grindebacke等[8]發現雖然來自過敏癥者和非過敏癥者的CD4+CD25+T調節細胞在花粉傳授季節均可以有效地抑制T細胞的增殖,但是過敏癥者的CD4+CD25+T調節細胞不能有效抑制花粉誘導的Th2型細胞因子的產生,但可抑制 Th1型細胞因子(IFN-γ)的產生。推測CD4+CD25+T調節細胞可通過抑制CD4+CD25-T淋巴細胞過度增殖、抑制Th2型細胞因子過度產生,在哮喘的發病機制中起重要作用。而哮喘患者體內CD4+CD25+T調節細胞存在功能缺陷,從而介導哮喘發病。但也有相反的觀點,Shi等[9]將CD4+CD25-T淋巴細胞與CD4+CD25+T調節細胞共同培養時,發現健康者和哮喘患者提供的細胞均被抑制,來自健康者和哮喘患者的CD4+CD25+T調節細胞之間的抑制功能沒有差別。本試驗發現,哮喘患者外周血分離的 CD4+CD25+T調節細胞可有效抑制Th1型細胞因子(IFN-γ)的分泌,并可有效抑制 Th2型細胞因子(IL-5)的分泌,而對IL-13的分泌則無明顯抑制作用。健康者分離的CD4+CD25+T調節細胞對Th1型細胞因子(IFN-γ)及Th2型細胞因子(IL-5、IL-13)的產生均有抑制作用。提示哮喘患者CD4+CD25+T調節細胞在抑制Th2型細胞因子產生的功能上存在部分缺陷。

糖皮質激素是治療哮喘的一線用藥,關于其對 CD4+CD25+T調節細胞功能的影響,目前已有部分研究。有動物實驗發現給BA LB/c小鼠注射地塞米松后,小鼠淋巴器官尤其是胸腺中CD4+CD25+T調節細胞數量及CD4+CD25+/CD4+CD25-T淋巴細胞比例均升高。CD4+CD25+T調節細胞和CD4+CD25-T細胞對地塞米松表現出不同的凋亡反應,IL-2可選擇性地保護CD4+CD25+T調節細胞,地塞米松對CD4+CD25+T調節細胞的調節可能參與其抗炎及免疫抑制作用[10]。Dao Nguyen和 Robinson[5]在體外培養實驗中,激素預處理的CD4+CD25+T調節細胞在隨后與抗原誘導的CD4+CD25-T細胞共培養時,具有更強的抑制增殖的能力,該效應見于健康者及過敏癥者,后者增強的程度稍低。本實驗中,采用地塞米松預處理CD4+CD25+T調節細胞后,哮喘患者和健康對照者CD4+CD25+T調節細胞抑制Th2型細胞因子(IL-5、IL-13)分泌的能力均顯著增強,健康對照者CD4+CD25+T調節細胞抑制IFN-γ產生的能力亦增強。提示地塞米松可增強健康對照者及哮喘患者CD4+CD25+T調節細胞抑制 Th2型細胞因子產生的能力,且兩者對地塞米松的反應性無差異;地塞米松還增強健康對照者CD4+CD25+T調節細胞抑制Th1型細胞因子產生的能力。推測激素類藥物控制哮喘發作的機制之一可能是通過增強CD4+CD25+T調節細胞對Th2型反應的抑制能力來發揮作用,且哮喘患者與健康對照者CD4+CD25+T調節細胞對激素治療的反應無顯著差別。

氨茶堿也廣泛應用于治療哮喘方面。近年研究發現小劑量氨茶堿對哮喘患者有顯著的抗炎作用[2]。Jaffar等[11]發現在給予哮喘患者小劑量氨茶堿后,其氣道嗜酸性粒細胞浸潤程度降低,CD4+T細胞比例降低。Nie等[12]在對接受小劑量氨茶堿規律治療的哮喘患者的痰液研究后發現,痰中嗜酸性粒細胞比例降低,IL-5水平下降,但CD4+T細胞比例及IFN-γ水平無顯著變化。本實驗通過小劑量氨茶堿預處理CD4+CD25+T調節細胞后,發現健康對照者CD4+CD25+T調節細胞抑制Th2型細胞因子(IL-5、IL-13)能力顯著增強,而哮喘患者僅對IL-5抑制能力增強,兩者抑制IFN-γ生成的能力均無顯著改變。提示小劑量氨茶堿可增強健康者CD4+CD25+T調節細胞抑制Th2型細胞因子產生的能力,從而發揮免疫調節作用,氨茶堿對哮喘者CD4+CD25+T調節細胞的抑制能力也有增強,但增強程度不如前者。

綜上所述,本實驗認為與健康對照者比較,哮喘患者CD4+CD25+T調節細胞在抑制Th2型細胞因子產生方面存在部分功能缺陷;地塞米松可增強健康者和哮喘患者CD4+CD25+T調節細胞抑制Th2型細胞因子的能力,且兩者對該藥物反應無差別;氨茶堿也可增強健康者和哮喘者CD4+CD25+T調節細胞對Th2型細胞因子產生的抑制,但哮喘者對該藥物反應性不如健康者。從而為進一步研究CD4+CD25+T調節細胞與哮喘發病的關系及治療哮喘藥物發揮作用的機制方面提供依據。

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