RNA干擾沉默雄激素受體基因對前列腺癌細胞生長的抑制作用研究*

王洛夫,張 堯,蘭衛華,靳風爍,江 軍

(第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所泌尿外科,重慶400042)

前列腺癌具有雄激素依賴性,抗雄激素治療至少對80%的晚期前列腺癌有效,但絕大多數患者會在短期內發展為雄激素非依賴性前列腺癌,缺乏有效的治療方法[1-2]。目前有研究認為,前列腺癌的雄激素依賴性主要是雄激素受體(androgen receptor,AR)依賴性,AR不但在雄激素依賴性前列腺癌中具有重要作用,在雄激素非依賴性前列腺癌中也起著關鍵作用[3-4],因此,可針對 AR基因進行前列腺癌的基因治療。RNA干擾(RNAi)具有高效、高度基因特異性的特點,能沉默所有已知序列的基因,采用 RNA干擾技術沉默AR基因,將可能有效地抑制AR的表達,從而抑制前列腺細胞的生長。因此,本研究擬設計合成針對AR基因的小干擾RNA(siRNA)并轉染前列腺癌細胞,觀測其對AR基因的沉默作用及對前列腺癌細胞的生長抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗選用人前列腺癌細胞株LNCaP(購自美國ATCC),該細胞表達 AR,具有雄激素依賴性,同時該細胞對雌激素、孕激素甚至抗雄激素藥物敏感,具有雄激素非依賴性前列腺癌的特性。siRNA合成試劑盒Silencer·siRNA Construction Kit、siRNA轉染試劑 siPORTTMLipid Transfection Agent購自美國 Ambion公司,ReverTra Ace-α-逆轉錄試劑盒購自TOYOBO公司。

1.2 AR siRNA的設計 利用Ambion公司提供的siRNA設計軟件設計針對 AR cDNA(GeneBank序列號:M23263 N18624)符合特征的靶序列,同時設計陰性對照序列(GC含量與靶序列相同)。經初步分析選取了3個靶序列:5′-AAT GCA AAG GT T CTC TGC TAG-3′(位于 Exon1),5′-AAG GTC TTC TTC AAA AGA GCC-3′(位 于 Exon2),5′-AAA GTC AAG CCC ATC TAT TTC-3′(位于 Exon8);陰性對照序列 :5′-AAG TGC GAT CTA ACT GAC CTA-3′。 根據靶序列設計用于合成siRNA的寡核苷酸模板,反義鏈為靶序列,正義鏈為靶序列的互補序列,3′加T7啟動子引物序列CCTGTCTC。以上寡核苷酸模板均由上海生工生物工程公司合成。

1.3 AR siRNA的制備 采用 Ambion公司的Silencer·siRNA Construction Kit合成上述AR siRNA,按試劑盒操作說明書取等摩爾濃度的正、反義寡核苷酸模板與T7啟動子混合,70℃加熱混合物5min,室溫下放置5min,T7啟動子和寡核苷酸模板序列退火結合,然后用DNA聚合酶Klenow大片段補齊成為可用于轉錄的雙鏈DNA模板,分別用T7 RNA聚合酶進行體外轉錄,再將產物混合后于37℃水浴箱持續孵育過夜,形成雙鏈RNA。以DNA酶降解模板,同時用單鏈專一的核糖核酸酶(RNase)消化5′的引導序列,由于 RNase不能切開 U堿基,也不能降解雙鏈 RNA,所以得到的產物就是所需的21bp的雙鏈 siRNA,有19對堿基互補,3′端各有2個 U突出。按試劑盒操作說明書進行純化,得到的siRNA用去核酸酶的水溶解,紫外分光光度計定量,-20℃保存備用。將3種靶序列合成的AR siRNA依次命名為AR siRNAⅠ、AR siRNAⅡ、AR siRNAⅢ。

1.4 AR siRNA轉染前列腺癌細胞 取對數生長期LNCaP細胞接種于6孔板(5×105/孔),培養細胞至密度為50%～60%。采用siPORTTMLipid T ransfection Agent進行siRNA轉染,簡要步驟如下:取4μ L siPORTTMLipid Transfection A-gent,加入OPTI-MEM Ⅰ reduced serum medium使終體積為15μ L,充分混勻,室溫孵育 10～30min。用OPTI-MEM Ⅰ reduced serum medium稀釋 siRNA至終體積 185μ L(終濃度25nM)。將稀釋的siRNA加入到稀釋的siPORTTMLipid Transfection Agent中,室溫孵育 15～20min。用 OPTI-MEMⅠreduced serum medium將細胞洗一遍,然后加入新鮮的OPTI-MEM Ⅰ 至800μ L。加入 siPORTTMLipid T ransfection A-gent/siRNA復合物至每孔,使終體積為1 000μ L,在常規細胞培養條件下孵育4h,加1～2mL新鮮的常規培養基繼續培養。每種AR siRNA轉染重復3次,觀察細胞生長狀況,挑選對LNCaP抑制作用最強的一組AR siRNA進行下一步實驗。

1.4 AR siRNA對AR基因轉錄的影響 實驗分3個組,A組:以抑制作用最強的AR siRNA轉染LNCaP,稱為 AR siRNA干預組;B組:以陰性對照siRNA轉染LNCaP,稱為無關對照組(mock control);C組:只加脂質體,稱為空白對照組(control)。轉染48h后,采用 Trizol試劑(Invitogen)提取細胞總RNA,用DNA酶消化后,電泳證實提取 RNA成功,以隨機六聚體引物反轉錄為 cDNA,反應條件:42℃、10min→30℃、20min→99℃、5min→4℃、5min,然后以 A R 引物 P1、P2 進行PCR,以 GAPDH 作為內參照,引物序列:P1 5′-AAG CCA TTG AGC CAG GTG TAG TG-3′,P2 5′-AAC CAG ATC AGG GGC GAA GTA GA-3′,GAPDH 引物:5′-ACC CAT CAC CAT CTT CCA GGA G-3′(上 游 引 物),5′-GAA GGG GCG GAG ATG ATG AC-3′(下游引物),反應條件:94℃、5min→(94℃、30s→58℃、30s→72℃、30s)×28→72℃、10min,擴增片段的長度 AR為 275bp,GAPDH為159bp。PCR產物采用圖像掃描儀拍照并進行灰度分析,以AR/GAPDH的比值代表相對含量。

1.6 細胞生長曲線 接種LNCaP于24孔板,每孔接種3×104個細胞,24h后按上述分組進行轉染,次日開始每天消化3孔記數,取平均值,繪制細胞生長曲線,計算細胞生長抑制百分率,計算公式:細胞生長抑制百分率(%)=(Nn-N)/(Nn-N0)×100%。其中N0為始接種細胞數,N為AR siRNA干預組細胞接種n天后的細胞數,Nn為對照組細胞接種n天后的細胞數。

2 結 果

2.1 siRNA的合成 采用Ambion公司的Silencer·siRNA Construction Kit合成的 AR siRNA是雙鏈 RNA,長度為21bp,經凝膠電泳證實成功合成了AR siRNA(圖1)。

2.2 AR siRNA轉染前列腺癌細胞及其對前列腺癌細胞生長的影響 將合成的3種AR siRNA轉染前列腺癌細胞LNCaP,與陰性對照和空白對照相比,發現3種A R siRNA對LNCaP細胞均有不同程度的抑制作用,但以AR siRNAⅡ對LNCaP細胞的生長抑制作用最強,表現為細胞生長停滯、脫壁,而對照組細胞生長旺盛,故選擇AR siRNAⅡ進行進一步的研究(圖2)。

2.3 AR siRNA對AR基因轉錄的影響 為明確AR siRNAⅡ轉染對靶基因的影響,本科進行了RT-PCR。結果表明,AR siRNAⅡ轉染 LNCaP細胞48h后,AR mRNA水平明顯下調,與空白對照組和無關對照組相比差異有統計學意義〔(0.302±0.028)vs(0.494±0.032),P＜0.01;(0.302±0.028)vs(0.534±0.034),P＜0.01〕,而無關對照組不引起靶基因AR mRNA水平的明顯變化〔(0.534±0.034)vs(0.494±0.032),P＞0.05〕,見圖 3。

圖1 合成的AR siRNA凝膠電泳(1%瓊脂糖凝膠)結果

圖2 各組細胞生長情況(光鏡 ×100)

圖3 RT-PCR產物凝膠電泳(1%瓊脂糖凝膠)結果

圖4 細胞生長曲線

2.4 細胞生長曲線 按上述分組繪制細胞生長曲線(圖4),可見AR siRNA干預組細胞生長明顯被抑制,細胞生長抑制率(相對空白對照組)為78.2%。

3 討 論

前列腺癌是西方工業國家最常見的惡性腫瘤之一,是美國男性常見的惡性腫瘤,其死亡率僅次于肺癌,居男性癌癥死亡的第2位;中國前列腺癌的發病率也呈上升趨勢。前列腺癌具有雄激素依賴性,抗雄激素治療至少對80%的晚期前列腺癌有效,但絕大多數患者會在短期內發展為雄激素非依賴性前列腺癌,缺乏有效的治療方法[1-2]。

目前,研究認為,前列腺癌的雄激素依賴性主要是AR依賴性,AR不單在雄激素依賴性前列腺癌中具有重要作用,在雄激素非依賴性前列腺癌中也起著關鍵作用[3-4],表現在:(1)AR表達增加,幾乎所有雄激素非依賴性前列腺癌均表達AR,且大多數病例高于原發性腫瘤。AR表達增加的機制之一是AR基因擴增,在進行抗雄激素治療后發生雄激素非依賴性轉變的前列腺癌患者,約30%有AR基因擴增。A R表達增加使得在低濃度雄激素環境中雄激素-雄激素受體通路仍可被激活。(2)AR基因突變,突變的AR可被雄激素以外的甾體激素激活。(3)生長因子或細胞因子以配基非依賴的方式激活。(4)過量表達AR共激活因子,如ARA-70等,使 AR的活性大幅度提高。這些細胞盡管對抗雄激素治療抵抗,但卻對AR具有高度依賴性,因此,阻斷這些細胞的AR表達應該可以起到治療作用。這對攻克雄激素非依賴性前列腺癌這一前列腺癌治療領域的難題無疑是有益的嘗試。Eder等[5]采用AR反義寡核苷酸阻斷AR蛋白表達,抑制了前列腺癌細胞LNCaP的生長,本科采用逆轉錄病毒載體介導的 AR反義RNA抑制AR表達也取得了類似的結果[6-7]。因LNCaP具有雄激素非依賴性前列腺癌的一些特性,如在無雄激素的環境中,雌激素、孕激素、細胞因子等仍能通過激活AR而使LNCaP生長。因此,上述研究表明AR在雄激素非依賴性前列腺癌的治療中極具價值。但這些實驗中反義核酸對AR表達的抑制程度及對前列腺癌細胞的生長抑制程度仍偏低,仍需尋找更有效的方法。

RNA干擾是一種在細胞內導入與特定基因序列相同的雙鏈RNA(dsRNA)而特異關閉基因的方法,即用20多個核苷酸組成的siRNA代替傳統反義核酸進行轉錄后基因沉默,目前該技術已經迅速而廣泛地應用到基因功能、基因表達調控機制研究等熱門領域,并為基因治療開辟了新的途徑[8-9]。RNAi具有高效、高度基因特異性的特點,能沉默所有已知序列的基因,且RNA干擾在基因沉默方面比反義RNA和反義寡核苷酸更有效。因此,設計合成針對AR的特異dsRNA并導入到前列腺癌細胞,使AR基因沉默,將可能更有效地抑制AR的表達,從而抑制前列腺癌細胞的生長。所以,本研究在既往研究的基礎上,選用RNA干擾技術沉默雄激素受體基因。

通過設計、合成多個AR siRNA,轉染前列腺癌細胞LNCaP,本研究篩選出了一個對其生長抑制作用最強的AR siRNA,RT-PCR證實前列腺癌細胞的AR mRNA水平顯著降低,LNCaP細胞生長被顯著抑制,細胞生長抑制率為78.2%。以上結果表明AR siRNA可沉默AR基因,并進一步抑制前列腺癌細胞的生長。由于LNCaP存在基因突變,雌激素、孕激素甚至抗雄激素藥物可刺激其生長,具有雄激素非依賴性前列腺癌的一些特征,故本研究結果提示AR siRNA可能對雄激素非依賴性前列腺癌也有生長抑制作用。

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