VEGF基因真核表達載體的構建及其在骨髓間充質干細胞中的表達*

張從紀,楊彥春,單佑安

(第三軍醫大學西南醫院口腔科,重慶400038)

骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有向其他細胞分化的巨大潛能。多種生物組織工程和創傷修復研究結果充分展示了MSCs作為種子細胞在創傷愈合過程中的潛在應用前景[1]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是主要的促進創傷愈合的因子[2],本研究將VEGF DNA轉染到MSCs中,增強其在MSCs中的表達,進一步促使MSCs分化為成熟血管內皮細胞以加速創傷愈合過程,為創傷的救治提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑pcDNA3.0-VEGF165質粒、攜帶GFP標記基因的pTrack-CM V轉移載體、pAdEasy-1腺病毒載體、菌株DH5α由單佑安博士惠贈。主要試劑:PacⅠ、PmeⅠ 、BgⅢ 、SaⅡ 、XhoⅠ 、EcroⅤ(Takara公司),T4 DNA 連接酶、Taq DNA聚合酶(上海申能博彩生物技術有限公司),Lipofectamine Reagent(Invitrogen公司),ELISA檢測試劑盒(晶美公司),MM LV反轉錄酶,λ-HindⅢ digest DNA marker(MBI公司),RNA抽提試劑盒(上海Sangon公司)等。

1.2 MSCs的分離與純化 無菌條件下采集骨髓3mL,用1∶50肝素抗凝,加入等量PBS液洗滌離心(1 000×g離心5min),棄上清液。加入PBS液4mL制備細胞懸液,緩慢加入等量的Percoll分離液(1.073g/L)1 800×g離心20min,收集白膜層的單個核細胞,用PBS液洗滌(1 000×g離心5min)2次,棄上清液,重新懸于含有10%PBS的DM EM/F12培養液中,按105～106/mL的密度接種于25cm2塑料培養瓶中,置于37℃、5%CO2、飽和濕度的孵育箱內培養。24h內首次全量換液,其后每3～4天半量換液,至細胞匯合成單層后進行胰酶消化傳代,選取第3代細胞進行鑒定,鑒定選用CD29、CD34、CD44、CD45。

1.3 VEGF基因腺病毒表達載體的構建

1.3.1 重組轉移質粒pTrack-CMV-VEGF165的構建 根據VEGF165序列設計合成上下游引物,VEGF正義鏈5′-TTGCTGCTCTACCTCCAC-3′, 反 義 鏈 5′-AATGCTT TCTCCGCTCTG-3′,長度為487bp。以本科室原有的經測序正確的pcDNA3.0-VEGF165質粒為模板,用上述引物進行PCR擴增,獲得的PCR產物經瓊脂糖電泳鑒定。將純化的PCR產物和質粒pTrack-CMV分別經 XhoⅠ、EcroⅤ雙酶切后,用膠回收試劑盒回收目的片段,用T4 DNA連接酶連接過夜,氯化鈣法轉化DH5α感受態菌,挑取后單克隆,PCR擴增,雙酶切后測序鑒定。

1.3.2 重組腺病毒載體的構建 將測序正確的pTrack-CM V-VEGF165基因重組質粒和空載體質粒用PmeⅠ單酶切線性化,膠回收與pAdEasy-1腺病毒載體用氯化鈣法共轉化BJ5183感受態,酶切后鑒定陽性克隆,獲得重組腺病毒載體,轉化DH5α感受態菌,大量擴增陽性克隆。

1.3.3 重組腺病毒的包裝及擴增 按質粒抽提試劑盒說明書操作提取重組腺病毒質粒和空載體質粒,經PacⅠ線性化后,按Lipofectamine Reagent操作說明書轉染293細胞,增養3～5d后,在熒光顯微鏡下觀察GFP熒光,7～10d收集細胞,-70℃、37℃反復凍融,離心收集上清液,獲取初毒,同法進行大量擴增,氯化銫純化病毒。倍比稀釋法檢測病毒滴度,本實驗的病毒滴度為2.45×1010PFU/mL。

1.4 VEGF轉染體外擴增的MSCs

1.4.1 Ad-VEGF165轉染體外擴增的MSCs 取3～6代MSCs按 1×105/孔的密度接種于24孔板中,培養24h后吸出培養液,加入用上述培養液作系列稀釋的Ad-VEGF165,1×103(b)、1×105(c)、1×106(d)、1×107(e)、1×108(f)、1×109(g)、1×1010(h)PFU/mL,每個滴度加入 4孔,另設 4孔作為未加入病毒的空白對照(a),繼續培養48h,定期觀察轉染率。

1.4.2 MSCs增殖的檢測 采用CCK-8法檢測細胞增殖,將MSCs按5×103/200μ L接種 96孔板。分為不同滴度病毒轉染組和空白對照組,24h后,每孔加入 10μ L CCK-8,繼續培養4h,用WellScan MK22型酶標儀450nm波長測定每個孔的吸光度值(A),連續檢測7d。繪制生長曲線,同時觀察細胞形態變化。

1.4.3 MSCs中VEGF mRNA含量的檢測[3]采用RT-PCR法,分別于轉基因后 24、48、72h 和 5、7、10、14d 按照 RNA 提取試劑盒說明書提取MSCs總RNA,VEGF引物如前所述;內參照β-肌動 蛋 白(β-actin)5′端 引物 序 列 為 5′-AAGGTGACCCAGAT-CATGTT TGAG-3′,3′端引物序列為 5′-AGGAGGAGCAATGATCTTGATCTT-3′,DNA 長度為 289bp。采用RT-PCR試劑盒進行RT-PCR反應。反應結束后取8μ L PCR產物經1.2%的普通瓊脂糖凝膠電泳后,用溴化乙啶染色,電泳完畢后在紫外燈下觀察照相,密度掃描分析PCR產物帶。將VEGF與β-actin比值作為 VEGF表達水平的參數,對VEGF PCR產物相對定量。

2 結 果

2.1 pTrack-CMV-VEGF165重組轉移質粒及重組腺病毒載體的構建 以pcDNA3.0-VEGF165質粒為模板進行PCR,能擴增出VEGF165目的片段,重組載體pTrack-CMV-VEGF165 PCR擴增后,經XhoⅠ、EcroⅤ雙酶切后同樣能釋放出 487bp大小的片段,表明VEGF165的基因已成功亞克隆于pTrack-CM V轉移質粒中(圖1)。DNA序列測定進一步證實成功構建了pTrack-CMV-VEGF165重組轉移質粒。基因VEGF165成功克隆至腺病毒穿梭載體pTrack-CMV中,pTrack-CMVVEGF165重組轉移質粒與骨架DNA在細菌BJ5183中成功重組出腺病毒pAd-VEGF165,重組的腺病毒質粒經PacⅠ酶切后出現一大一小2個片段,大片段約23kb,小片段約4.0kb,與預期的譜形相同,證實重組腺病毒成功(圖2)。

圖1 pTrack-CMV-VEGF165重組轉移質粒鑒定電泳圖

2.2 分離、培養MSCs細胞 骨髓細胞培養4h貼壁,形態均一,呈長梭形,貼壁細胞增殖迅速,10～14d后接近融合呈成纖維狀形態(圖3)。表面標志CD34、CD35陰性表達,而 CD29、CD44陽性表達,說明所培養的細胞非造血干細胞。

圖2 重組腺病毒pAd-VEGF165經PacⅠ酶切電泳圖

圖3 第3代MSCs形態(倒置相差顯微鏡,×20)

2.3 轉染VEGF165后MSCs增殖及形態變化 MSCs轉染pAd-VEGF165后每天在熒光顯微鏡下觀察各滴度的熒光表達,激發波長為488nm、發射波長為507nm,轉染率=暗視野所見發綠色熒光的細胞數/明視野所見細胞數。轉染后24h可見熒光,7d時熒光表達最強,其不同病毒滴度的轉染率:1×103PFU/mL為0、1×105PFU/mL為12%、1×106PFU/mL為34%、1×107PFU/mL為56%、1×108PFU/mL為 78%、1×109PFU/mL為85%、1×1010PFU/mL為85%。

腺病毒載體轉染后MSCs細胞仍貼壁生長,呈梭形或多角形,有分裂增殖,但速度有所降低。熒光顯微鏡下,24h可見細胞有綠色熒光表達,但強度較低,48h可見細胞有強烈熒光表現,呈全細胞分布,7d熒光表達最強。CCK-8結果提示:a、b、c 3個組間差異無統計學意義(P＞0.05),其余組與a組相比差異有統計學意義(P＜0.01),說明病毒滴度在105PFU/mL以下時,對細胞活力無明顯影響,滴度大于106PFU/mL時,開始對細胞增殖產生抑制,而且隨劑量增加,抑制作用越明顯,從細胞生長曲線還可以看出,4d后病毒對d、e、f、g組細胞增殖能力的抑制漸弱,而 h組細胞8d時抑制作用仍明顯(圖4)。

2.4 轉VEGF基因后MSCs中VEGF的水平變化 提取標本總RNA,經紫外分光光度計檢測A260/A280值為1.8～2.0,證明無蛋白質污染。提取RNA總濃度為0.5～2.0g/L。由于β-actin幾乎存在于所有細胞中,并且含量相對穩定,VEGF的基因表達程度以VEGF mRNA相對于β-actin mRNA取得。由圖5可見,轉基因后于48～72h達到表達高峰。

圖4 各組細胞的生長曲線

圖5 不同時間段MSCs中VEGF mRNA/β-actin mRNA值變化情況

3 討 論

MSCs具有向其他細胞分化的巨大潛能,近年來其分化潛能不斷被發現,已徹底打破了固有的認識。中胚層起源的MSCs不但可分化為骨骼、肌肉等中胚層組織,也可以跨胚層分化為外胚層的神經元和上皮組織,還可分化為內胚層的心肌細胞、肝細胞和腎小管上皮細胞[3-5]。在創傷條件下,MSCs能分化成血管內皮細胞及表皮細胞參與創傷的修復過程,因此在生物組織工程和創傷修復的研究中MSCs占據了重要位置。可以設想,如果能調控MSCs轉化為血管母細胞,繼而分化為成熟血管內皮細胞,將有效地加速創傷的愈合過程,為創傷的救治提供新的方法。

機體損傷后出現協調的愈合過程,其中包括多種細胞、細胞因子和細胞外基質之間錯綜復雜的網絡作用。細胞因子在創傷愈合過程中具有重要作用,它能調節創傷修復過程中的多種細胞反應,影響細胞增殖、遷移、細胞外基質合成和釋放等[6-7]。在眾多細胞因子中,VEGF在血管的再生過程中起著重要的作用,無論是在傷前組織還是傷后不同修復階段的組織中,VEGF均呈持續性陽性表達,它通過促進血管內皮細胞的有絲分裂、血管通透性的增加以及協助釋放其他生長因子等方式促進局部血管的再生,被公認為首選的促血管生長因子[8-10]。

本實驗使用構建的帶有VEGF165的重組腺病毒感染培養的MSCs,滴度為1×107PFU/mL時可獲得56%的感染率,且轉染率隨病毒滴度的增加而有所增加,1×109PFU/mL是轉染的最佳滴度,超過此滴度不能提高其轉染率,并且對細胞的毒性作用明顯。對轉染細胞增殖活性的生長曲線分析說明,滴度在1×105PFU/mL以下對細胞增殖無明顯影響,隨著滴度增加,對細胞的增殖有所影響,主要表現在轉染病毒的早期,持續約4d左右,之后細胞的增殖能力漸恢復。病毒滴度在1×1010PFU/mL時,對細胞的增殖影響最為明顯。表明病毒滴度在1×106～1×109PFU/mL時,可以高效轉染,并對細胞增殖影響較小,對后續研究無明顯影響。

本實驗結果顯示,MSCs在轉染VEGF之后24h即檢測到基因表達,至72h達表達高峰,之后逐漸下調并維持2周左右時間。說明外源性的VEGF已成功轉染到目的細胞體內,并得以正常表達。雖然其表達為2周左右時間,但在促進創傷愈合方面可能會起到促進作用,因一般創面愈合時間為1周左右。

[1]Asmis R,Qiao M,Rossi RR,et al.Adriamycin promotes macrophage dysfunction in mice[J].Free Radic Biol Med,2006,41(1):165.

[2]張從紀,李慧增,周樹夏,等.頜面部爆炸傷早期愈合過程中血管內皮生長因子及其受體表達的實驗研究[J].重慶醫學,2001,30(1):8.

[3]周光紀,徐海偉,屈紀富,等.胚胎干細胞來源的巢蛋白陽性細胞向胰島素分泌細胞分化的實驗研究[J].生物醫學工程與臨床,2007,11(2):143.

[4]Husnain Kh,Muhammad A.Bone marrow stem cell transplantation for cardiac repair[J].Am J Physiol Heart Circ Physilo,2005,288:H2557.

[5]Braun M,Lelieur K,Kietzmann M.Purinergic substances promote murine keratinocyte proliferation and enhance impaired wound healing in mice[J].Wound Repair Regen,2006,14(2):152.

[6]Porock D,Nikoletti S,Cameron F.The relationship between factors that impair wound healing and the severity of acute radiation skin and mucosal toxicities in head and neck cancer[J].Cancer Nurs,2004,27(1):71.

[7]Zhou H,Ramiya VK,Visner GA.Bone marrow stem cells as a vehicle for delivery of heme oxygenase-1 gene[J].Stem Cells Dev,2006,15(1):79.

[8]CrollSD,Goodman JH,Scharfman HE.Vascular endothelial growth factor(VEGF)in seizures:a double-edged sword[J].Adv Exp Med Biol,2004,548:57.

[9]張從紀,李慧增,周樹夏,等.大鼠頜下腺血管內皮生長因子cDNA的轉移及表達[J].重慶醫學,2003,32(11):1476.

[10]Kraus KH,Kirker-Head C.Mesenchymal stem cells and bone regeneration[J].Vet Surg,2006,35(3):232.