黃蒲通竅膠囊對(duì)擬血管性癡呆大鼠神1經(jīng))細(xì)胞c-fos、c-jun蛋白表達(dá)的影響

劉 妮,謝道俊,曹仕健,陳永華,江停戰(zhàn),汪遠(yuǎn)金,

胡業(yè)彬,李之和,黃 為,尹良勝,王莉莉

腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制尚未完全明了,可能與腦缺血再灌注時(shí)氧自由基增多、鈣超載及興奮性氨基酸釋放有關(guān),但更重要和更直接的是凋亡細(xì)胞內(nèi)活躍的基因表達(dá)。原癌基因尤其是c-fos和c-jun在細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和胞內(nèi)信號(hào)傳遞分泌中具有極為重要的作用。細(xì)胞凋亡控制基因在腦缺血損害中參與凋亡的發(fā)生,升高的c-fos和c-jun參與神經(jīng)細(xì)胞凋亡[1]。本研究基于腦缺血再灌注損傷后的血管性癡呆(VD)大鼠模型,探討中藥黃蒲通竅膠囊對(duì)VD大鼠學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因,同時(shí)也是神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)調(diào)控基因c-fos和c-jun的影響,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)于2004年5月在安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行。選用健康成年雄性Wistar大鼠100只,體質(zhì)量(300±20)g,由河南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):豫醫(yī)動(dòng)字410157號(hào)。

1.2 藥物及試劑 黃蒲通竅膠囊(主要由人參、大黃、益智仁等組成)由安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院提供,批號(hào):20030816,0.4 g,實(shí)驗(yàn)前將黃蒲通竅膠囊內(nèi)粉溶于蒸餾水中,配成0.084 g/mL的濃度;都可喜(Duxil,每片含阿米三嗪30 mg及蘿巴新10 mg):法國(guó)施維雅(SERVIER,批號(hào):2M0153)藥廠,溶于蒸餾水中,配成0.7 g/mL濃度的溶液,冰箱保存。c-fos和 c-jun多克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物公司。

1.3 主要儀器 電子天平FA2104MAX210型由上海儀器廠生產(chǎn);S?C202型電熱恒溫干燥箱由浙江省嘉興市新騰電器廠生產(chǎn);KDC-2046低速冷凍離心機(jī)。

1.4 干預(yù)措施 參照 Nagasawa等[2]和Zea Longa等[3]的方法加以改進(jìn)制作線栓法大腦中動(dòng)脈栓塞模型。阻斷該側(cè)大腦中動(dòng)脈的血流導(dǎo)致腦缺血。再次結(jié)扎入口處,尼龍線外留約1 cm,縫合皮膚。2 h后輕輕提拉所留線頭至有阻力實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈再灌,則造模完成。假手術(shù)組手術(shù)過(guò)程同上,插線深度為1.5 cm。正常組大鼠不作任何手術(shù)處理。所有手術(shù)動(dòng)物縫合前切口處涂上慶大霉素溶液,術(shù)后肌肉注射青霉素2×104U/100 g,1次/日,連續(xù)3 d以預(yù)防感染。購(gòu)買后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,然后開始造模。術(shù)前、術(shù)后各禁食12 h,術(shù)后保溫飼養(yǎng)。

1.5 分組及處理 于缺血2 h～6 h內(nèi)觀察動(dòng)物的軀體感覺(jué)和動(dòng)物功能,按Zea Longa[4]5分制為神經(jīng)病學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分:0分,無(wú)神經(jīng)損傷癥狀;1分,不能完全伸展對(duì)側(cè)前或后爪;2分,向手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分,向手術(shù)對(duì)側(cè)傾倒;4分,不能自發(fā)行走,意識(shí)喪失。1分(包括 1分)以上為造模成功,低于1分則未成功,棄去。

各組動(dòng)物分組如下:空白組15只;假手術(shù)組15只。余下70只全部造模,隨機(jī)選取造模成功大鼠45只,按隨機(jī)數(shù)據(jù)表分成3組,每組15只,即模型組、中藥組(黃蒲通竅膠囊組)、陽(yáng)性對(duì)照組(都可喜組)。中藥組:按臨床成人劑量的7倍給藥,即0.42 g/kg。按照大鼠體質(zhì)量以0.01 ml/g的劑量灌胃給藥。陽(yáng)性對(duì)照組,按照大鼠體質(zhì)量以0.01 ml/g的劑量灌胃給藥。空白組、假手術(shù)組和模型組與中藥組和陽(yáng)性對(duì)照治療組同時(shí)予以蒸餾水灌胃,按照大鼠體重以0.01 ml/g的劑量灌胃。各組大鼠造模結(jié)束第 2天開始給藥,1次/日,連續(xù)處理28 d。

1.6 組織處理 斷頭取腦,除去小腦和腦干,取缺血側(cè)半腦,從視交叉處冠狀面切開,放入相同的固定液中固定1周,制作腦部冠狀切片。

1.7 觀察指標(biāo) c-fos、c-jun免疫組化染色,用博士德公司推薦的SABC法。在額頂葉皮質(zhì),相近部位同倍的6個(gè)不同視野,統(tǒng)計(jì)上述3組指標(biāo)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比率以及陽(yáng)性細(xì)胞的著色深淺度,取平均值。陰性對(duì)照采用正常山羊血清替代第一抗體進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 黃蒲通竅膠囊對(duì)大鼠腦組織c-fos的影響(見(jiàn)表1)

表1 各組大鼠腦組織c-fos的表達(dá)(±s)

表1 各組大鼠腦組織c-fos的表達(dá)(±s)

組別 陽(yáng)性(個(gè))比例(%)著色深淺(分)空白組 55.33±2.74 78.93±1.29 3假手術(shù)組 58.34±3.16 80.56±2.43 3模型組 76.17±1.983) 83.62±2.013) 4中藥組 94.33±3.342) 93.85±1.962) 4都可喜組 91.50±2.262) 89.32±2.221) 3與模型組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與空白組比較,3)P＜0.01

2.2 黃蒲通竅膠囊對(duì)大鼠腦組織c-jun的影響(見(jiàn)表2)

表2 各組大鼠腦組織c-jun的表達(dá)(±s)

表2 各組大鼠腦組織c-jun的表達(dá)(±s)

組別 陽(yáng)性(個(gè))比例(%)著色深淺(分)空白組 56.50±2.24 67.06±2.22 3假手術(shù)組 64.56±3.12 69.86±1.86 3模型組 65.83±2.482) 78.36±1.232) 3中藥組 83.67±1.981) 91.11±1.731) 3都可喜組 81.33±2.361) 87.32±2.041) 3與模型組比較,1)P＜0.01;與空白組比較,2)P＜0.05

3 討 論

腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的信息傳遞經(jīng)跨膜傳導(dǎo)機(jī)制,激活細(xì)胞內(nèi)第二信使系統(tǒng),在引起細(xì)胞瞬時(shí)反應(yīng)的同時(shí),可激活第三信使,引起基因轉(zhuǎn)錄變化即刻早期基因c-fos及其所編碼的蛋白可作為核內(nèi)第三信使,在神經(jīng)信號(hào)的傳遞過(guò)程中起重要作用,它能將外界短時(shí)程的傳入信號(hào)和長(zhǎng)時(shí)程的基因表達(dá)偶聯(lián)起來(lái),調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的多種后期效應(yīng)基因表達(dá),從而使神經(jīng)細(xì)胞的可塑性及興奮性發(fā)生改變[4]。在正常情況下,c-fos在神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)很低,參與細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖、分化、信息傳遞和人的學(xué)習(xí)、記憶等生理過(guò)程。生理性刺激和病理情況下均能短暫地誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)c-fos表達(dá)。腦缺血是即早基因強(qiáng)有力的誘導(dǎo)劑,近年的研究表明,腦缺血導(dǎo)致c-fos表達(dá)呈兩種方式:短暫而快速的表達(dá)[5,6],延遲的表達(dá)[7]。

c-jun與 c-fos關(guān)系密切,外界刺激后,fos和jun的mRNA可短暫地在胞漿內(nèi)積累,并翻譯出相應(yīng)的蛋白質(zhì)fos和jun,跨核膜轉(zhuǎn)入核內(nèi),二者通過(guò)亮氨酸拉鏈形式構(gòu)成1∶1異源二聚體,是fos和jun的活性形式,可與靶基因上調(diào)節(jié)區(qū)(AP1位點(diǎn))結(jié)合,影響靶基因表達(dá)。已有報(bào)道,抗c-jun的低聚核苷酸可以一種程序特異性的方式影響學(xué)習(xí)記憶過(guò)程,提示c-jun在學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中具有特異性作用[8]。

用T UNEL法在缺血側(cè)基底皮層與丘腦可見(jiàn)凋亡細(xì)胞,梗死中心的尾殼核只見(jiàn)少量散在凋亡細(xì)胞。免疫組化測(cè)得缺血側(cè)皮層與丘腦c-fos表達(dá)性增高,非梗死區(qū)的扣帶回皮層也見(jiàn)大量c-fos。張玲等[9]研究證實(shí),腦缺血及再灌注損傷可誘導(dǎo)c-fos基因的表達(dá),且在相同腦區(qū)內(nèi)見(jiàn)到細(xì)胞凋亡,表明c-fos表達(dá)在細(xì)胞凋亡中可能起一定作用。國(guó)內(nèi)尚有研究結(jié)果顯示腦缺血再灌注損傷可誘導(dǎo)c-fos和c-jun蛋白的表達(dá),且表達(dá)區(qū)域與細(xì)胞凋亡一致,主要位于半暗帶區(qū),提示c-fos和c-jun的表達(dá)可能在腦缺血再灌注導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起一定作用[10]。腦缺血后c-fos基因在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的高表達(dá)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。然而c-fos基因高表達(dá)在腦缺血及缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制尚未明了,兩者間的關(guān)系也存在許多爭(zhēng)議[11]。c-fos表達(dá)后的 Fos蛋白具有雙重效應(yīng),既可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡,又能參與細(xì)胞損傷后的修復(fù)。Kamme等[12]在觀察低溫對(duì)腦缺血后神經(jīng)元的影響時(shí)提出低溫可影響c-fos的表達(dá),并可能干擾腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。王雪等[13]也提出以c-fos基因的雙效假說(shuō),認(rèn)為在神經(jīng)細(xì)胞系統(tǒng)修復(fù)/防御系統(tǒng)完全被抑制時(shí),c-fos參與凋亡,未被抑制時(shí)參與神經(jīng)細(xì)胞的損傷后修復(fù)。

關(guān)于腦缺血后c-fos的表達(dá)與學(xué)習(xí)記憶之間的關(guān)系,Shigeno等[14]通過(guò)對(duì)腦缺血后海馬、下丘腦神經(jīng)細(xì)胞中 NGFmRNA、c-fosmRNA的觀察,揭示c-fos可能通過(guò)上調(diào)腦缺血損傷區(qū)的NGF基因表達(dá),使腦缺血后海馬、下丘腦區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞NGF量增加,從而延遲和部分抑制了該區(qū)域的細(xì)胞凋亡進(jìn)程。利用反義核酸技術(shù)抑制腦內(nèi)c-fosmRNA的表達(dá),發(fā)現(xiàn)c-fosmRNA對(duì)大鼠Y迷宮的學(xué)習(xí)行為沒(méi)有影響,但大鼠分辯記憶的保持能力卻明顯減弱,證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子c-fos與長(zhǎng)期記憶有關(guān)[15]。包新民等[16]用Y迷宮證明大鼠全腦缺血5 d后,學(xué)習(xí)記憶能力顯著降低,同時(shí)觀察到紋狀體邊緣區(qū)內(nèi)的神經(jīng)元明顯缺失,c-fos蛋白一過(guò)性表達(dá)增高,提示全腦缺血后導(dǎo)致的海馬以及邊緣區(qū)等在內(nèi)的神經(jīng)元損傷,可能是造成全腦缺血后學(xué)習(xí)記憶功能障礙的原因。張雪朝等[17]通過(guò)對(duì)VD大鼠的針刺干預(yù)研究,推測(cè)針刺腦、腎耳穴后,可能加強(qiáng)了c-fosmRNA及蛋白在海馬CA1區(qū)的表達(dá)。

本組資料結(jié)果顯示,腦缺血4周后模型組大鼠c-fos和c-jun有一定的表達(dá),中藥組大鼠c-fos和c-jun的表達(dá)明顯增強(qiáng),提示黃蒲通竅膠囊一方面可能通過(guò)上調(diào)腦缺血后某些抑制凋亡基因的表達(dá),延遲和抑制了腦缺血后細(xì)胞凋亡的進(jìn)程,而起到腦保護(hù)的作用;另一方面表達(dá)增強(qiáng)的Fos蛋白可能作為細(xì)胞核的第三信使,啟動(dòng)和調(diào)控某些與學(xué)習(xí)記憶功能相關(guān)的基因,最終起到改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的作用。

黃蒲通竅膠囊具有腦保護(hù)和改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的作用,其確切的機(jī)制尚不清楚。但本方的現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí),人參大補(bǔ)元?dú)?人參皂甙Rg-1能選擇性增強(qiáng)老年大鼠免疫功能,改善老年大鼠的行為活動(dòng)和操作能力,提高青、老年大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞功能,促進(jìn)海馬細(xì)胞內(nèi)c-fos基因的表達(dá),并對(duì)抗谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)毒作用以及對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用[18]。石菖蒲豁痰開竅,為治療痰蒙清竅之首品,《本經(jīng)適源》謂之可“開心孔,通九竅,明耳目,出聲音,總?cè)⌒翜乩[之力”。藥理學(xué)研究表明石菖蒲對(duì)癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶具有改善作用,其機(jī)制可能與石菖蒲的神經(jīng)元保護(hù)作用及突觸可塑性有關(guān)[19]。石菖蒲揮發(fā)油尤其是β-細(xì)辛醚有抑制大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用[20]。石菖蒲提取物在多種實(shí)驗(yàn)中有改善學(xué)習(xí)記憶障礙的作用,并能降低乙酰膽堿酯酶活力,增強(qiáng)c-jun基因表達(dá)[21]。這些可能是黃蒲通竅膠囊治療VD的重要機(jī)制。

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