澤蘭對(duì)人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響1)

聶 波,李佳彥,王碩仁,朱陵群,孫逸坤,崔 巍,牛福玲

澤蘭是一味傳統(tǒng)的活血化瘀中藥,為唇形科植物毛葉地瓜兒苗(Lycopus lucidus Turcz.var.hirtus Regel)的干燥地上部分,具有活血化瘀、行水消腫的功能[1]。目前,地瓜兒苗與毛葉地瓜兒苗臨床上均做澤蘭使用。以往的研究顯示:澤蘭具有抑制多種細(xì)胞增殖的作用,包括人成纖維細(xì)胞[2]、SPC-A-1人肺腺癌細(xì)胞[3]、人肝癌細(xì)胞(HepG2)和人急性早幼粒白血病細(xì)胞(HL-60)[4]等。但是關(guān)于澤蘭是否具有抑制血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)增殖的作用尚不清楚。VSMC異常增殖在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)病變發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵作用。有效地抑制VSMC增殖以阻斷動(dòng)脈粥樣硬化(AS)進(jìn)程具有重要的理論和臨床意義。因此,本研究以中藥澤蘭為研究對(duì)象,于體外培養(yǎng)的人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(human coronary artery smooth muscle cells,HCASMC)上,觀察澤蘭水提物和乙醇洗脫物對(duì)該細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期的影響,以探討澤蘭抗動(dòng)脈粥樣硬化的藥理作用,為動(dòng)脈粥樣硬化創(chuàng)新藥物開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 HCASMC(美國(guó)Cascade公司),每管含有 5×105個(gè)活細(xì)胞,系傳代培養(yǎng)至第三代后凍存所得。保存于液氮中。

1.2 藥物 澤蘭產(chǎn)于河北白洋淀,于2007年4月采集,由北京中醫(yī)藥大學(xué)鑒定為唇形科植物地瓜兒苗。用水提取,過(guò)濾,濃縮,離心除蛋白,冷凍干燥,得水提液干粉(LLST)。水提液濃縮后上AB-8大孔樹(shù)脂柱,水洗后,用95%的乙醇洗脫,收集95%乙醇洗脫液,冷凍干燥,得95%乙醇洗脫液干粉(LLCX)。

1.3 試劑 大孔樹(shù)脂AB-8(河北滄州保恩化工有限公司,藥用級(jí));M231基礎(chǔ)培養(yǎng)基(美國(guó)Cascade公司)。平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充劑(SMGS,美國(guó)Cascade公司。胰酶/EDTA(美國(guó) Gibco公司);RNA酶A和M TT均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.4 儀器 FD-1D-80℃冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康);128C-400自動(dòng)酶標(biāo)儀(奧地利,Clinicbio);LD5-2B低速離心機(jī)(北京雷勃爾離心機(jī)公司);FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó) BECTON DICKINSON公司);IMT-2倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.5 細(xì)胞的復(fù)蘇與傳代培養(yǎng) 取出含有HCASMC的凍存管,37℃水浴解凍,混勻,稀釋成濃度為1.25×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,種入75 cm2培養(yǎng)瓶中,每瓶加入細(xì)胞懸液15 mL,搖勻。將培養(yǎng)瓶置于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中。在細(xì)胞復(fù)蘇后24 h到36 h之間換液,之后每48 h換液一次。至細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí),以胰酶消化,傳代,進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.6 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)(MT T比色法)取培養(yǎng)第6～8代HCASMC,調(diào)整細(xì)胞密度至1×104/mL,以每孔100 μ L接種于96板,培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞生長(zhǎng)成融合狀態(tài)時(shí),隨機(jī)分組:空白組、不同濃度澤蘭 LLST 組(320 μ g/mL、640 μ g/mL、1 280μ g/mL 、2 560μ g/mL、5 120μ g/mL)和不同濃度澤蘭 LLCX(40μ g/mL、80 μ g/mL、160 μ g/mL 、320 μ g/mL 、640 μ g/mL)。 每組 設(shè) 6 個(gè)復(fù)孔 ,繼續(xù)培養(yǎng)2 4 h后,每孔加入2 0μ L MT T溶液(5 mg/mL),置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,終止培養(yǎng),吸棄孔內(nèi)上清液,每孔加入 150 μ L DMSO,震蕩10 min在 492 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔OD值。

1.7 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和DNA合成 取培養(yǎng)第6～8代HCASMC,調(diào)整細(xì)胞密度至 1.5×105/mL,將細(xì)胞接種于 6孔板,培養(yǎng)24 h,觀察待細(xì)胞長(zhǎng)成融合狀態(tài)時(shí),隨機(jī)分組:空白組、不同濃度澤蘭LLST給藥組,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,以0.125%胰蛋白酶和0.02%EDTA-Na2等量混合配比的消化液消化HCASMC,制備單細(xì)胞懸液,流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件,均數(shù)間經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。統(tǒng)計(jì)方法選用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 澤蘭LLST和LLCX對(duì)HCASMC增殖的影響

2.1.1 澤蘭LLST對(duì)HCASMC增殖的影響 在藥物作用24 h后,MT T結(jié)果顯示各藥物劑量組與空白組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),顯示良好的抑制增殖的作用;當(dāng)藥物濃度為320 μ g/mL,640 μ g/mL,1 280 μ g/mL 時(shí) ,三者不能呈良好的線性關(guān)系;當(dāng)藥物濃度為2 560 μ g/mL,5 120 μ g/mL時(shí),OD值顯示兩者接近于半數(shù)致死量,顯示該藥物具有一定的毒性。詳見(jiàn)表1。

表1 不同濃度澤蘭L LST對(duì)HCASMC增殖的影響(±s)

表1 不同濃度澤蘭L LST對(duì)HCASMC增殖的影響(±s)

藥物劑量 n OD值空白 6 0.314±0.063 320 μ g/mL 6 0.234±0.0151)640 μ g/mL 6 0.226±0.0131)1 280 μ g/mL 6 0.248±0.0171)2 560 μ g/mL 6 0.176±0.0351)5 120 μ g/mL 6 0.128±0.0661)與空白組比較,1)P＜0.05

2.1.2 澤蘭LLCX對(duì)HCASMC增殖的影響 在藥物作用24 h后,MT T結(jié)果顯示各藥物劑量組與空白組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),顯示良好的抑制增殖作用;當(dāng)藥物濃度為40 μ g/mL,80 μ g/mL,160 μ g/mL 時(shí),三 者不能呈良 好的線 性關(guān)系;當(dāng)藥物濃度為 320 μ g/mL,640 μ g/mL時(shí),OD 值顯示兩者接近于半數(shù)致死量,顯示該藥物具有一定的毒性。詳見(jiàn)表2。

表2 不同濃度澤蘭LLCX對(duì) HCASMC增殖的影響(±s)

表2 不同濃度澤蘭LLCX對(duì) HCASMC增殖的影響(±s)

藥物劑量 n OD值空白 6 0.294±0.028 40 μ g/mL 6 0.200±0.0221)80 μ g/mL 6 0.190±0.0121)160 μ g/mL 6 0.215±0.0521)320 μ g/mL 6 0.179±0.0341)640 μ g/mL 6 0.143±0.0301)與空白組比較,1)P＜0.05

2.2 澤蘭LLST和LLCX對(duì)HCASMC細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響與空白組相比,隨著澤蘭LLST和LLCX濃度的增加,細(xì)胞數(shù)目逐漸變少,當(dāng)濃度達(dá)到1 280 μ g/mL和 160 μ g/mL時(shí),部分細(xì)胞由星形的絲狀細(xì)胞變?yōu)榉叫位蛉切蔚募?xì)胞,當(dāng)濃度達(dá)到2 560 μ g/mL和320μ g/mL時(shí),死細(xì)胞數(shù)目增加;濃度達(dá)到 5 120 μ g/mL和5 640 μ g/mL時(shí),死細(xì)胞明顯增加,細(xì)胞嚴(yán)重變形。

2.3 澤蘭LLST和LLCX對(duì)HCASM細(xì)胞周期的影響

2.3.1 澤蘭LLST對(duì)HCASM細(xì)胞周期的影響(見(jiàn)表3)

表3 不同濃度澤蘭水提物(LLST)對(duì)HCASM細(xì)胞周期的影響(±s)%

表3 不同濃度澤蘭水提物(LLST)對(duì)HCASM細(xì)胞周期的影響(±s)%

藥物劑量 n G0/G1 S G2/M apoptosis空白 3 71.12±1.88 20.37±2.12 8.51±1.02 0.62±0.42 320 μ g/mL 3 73.03±1.46 16.95±1.601) 10.12±0.36 0.60±0.47 640 μ g/mL 3 76.81±1.43 14.33±1.331) 9.06±0.19 1.32±1.55 1 280 μ g/mL 3 82.60±1.061) 8.51±0.441) 8.89±1.08 0.83±0.69 2 560 μ g/mL 3 72.30±3.08 15.40±1.561) 12.30±2.29 1.33±0.81 5 120 μ g/mL 3 54.96±5.571) 31.20±2.881) 13.84±3.091) 21.48±1.751)與空白組比較,1)P＜0.05

2.3.2 澤蘭LLCX對(duì)HCASM細(xì)胞周期的影響(見(jiàn)表4)

表4 不同濃度澤蘭醇洗物(LLCX)對(duì)HCASM細(xì)胞的影響(±s)%

表4 不同濃度澤蘭醇洗物(LLCX)對(duì)HCASM細(xì)胞的影響(±s)%

藥物劑量 n G0/G1 S G2/M apoptosis空白 3 71.88±0.48 19.70±1.81 8.42±1.35 0.57±0.49 40 μ g/mL 3 72.48±0.89 18.05±0.84 9.47±0.92 0.60±0.13 80 μ g/mL 3 78.20±2.101) 13.34±1.591) 8.46±0.54 0.39±0.35 160 μ g/mL 3 85.75±1.481) 7.40±2.581) 6.86±1.11 0.47±0.29 320 μ g/mL 3 78.26±2.161) 12.78±1.921) 8.96±0.62 0.48±0.31 640 μ g/mL 3 55.48±4.081) 28.63±1.711) 14.89±3.881) 32.48±4.901)與空白組比較,1)P＜0.05

3 討 論

動(dòng)脈損傷后VSMC的異常增殖是動(dòng)脈粥樣硬化等血管增殖性疾病發(fā)生的重要因素[5]。其表型轉(zhuǎn)化是VSMC增殖和遷移的關(guān)鍵性起始步驟,主要表現(xiàn)為從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?獲得增殖、遷移和合成、分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)的能力。細(xì)胞外基質(zhì)的變化可直接或間接影響VSMC的增殖、黏附及遷移過(guò)程[6]。本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞采自正常HCASMC,其培養(yǎng)基有兩種:一種是維持其處于收縮態(tài)的培養(yǎng)基;另一種是促進(jìn)其由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變的培養(yǎng)基。本實(shí)驗(yàn)選用第二種培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基中添加了重組人堿性成纖維生長(zhǎng)因子(hbFGF)和重組人表皮生長(zhǎng)因子(hEGF)生長(zhǎng)因子,這些因子是使HCASMC由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變,其中 bFGF對(duì)VSMC有強(qiáng)烈的有絲分裂作用,可促進(jìn)VSMC增殖和遷移作用[7]。因此,本實(shí)驗(yàn)中的HCASMC在生長(zhǎng)因子的作用下處于增殖狀態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)M TT結(jié)果顯示澤蘭LLST的32 0μ g/mL、6 40 μ g/mL、1 280μ g/mL 濃度組和 LLCX 的 40 μ g/mL、80μ g/mL 、160 μ g/mL濃度組在作用 24 h以后,均能抑制細(xì)胞的增殖,該系列濃度均為安全濃度,但是未呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。本研究細(xì)胞周期結(jié)果顯示,隨著濃度的增加,停留于G0/G1期細(xì)胞比例逐漸增加,而處于S期的細(xì)胞比例逐漸減少,表明其抑制增殖作用逐漸增強(qiáng),但對(duì)G2/M期的調(diào)控作用均不明顯。

流式細(xì)胞結(jié)果顯示:澤蘭LLST和LLCX抑制增殖作用的最佳藥物濃度分別為 1 280 μ g/mL 和 160 μ g/mL,此時(shí),兩者鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞數(shù)目變少,部分細(xì)胞由星形的絲狀細(xì)胞變?yōu)榉叫位蛉切蔚募?xì)胞,提示平滑肌細(xì)胞由合成型逐漸轉(zhuǎn)變成為收縮型,兩者折合生藥的量分別為8166.4μ g/mL和9 644.8μ g/mL,說(shuō)明澤蘭具有抑制HCASMC增殖的活性。

本實(shí)驗(yàn)觀察到澤蘭兩種干粉的兩個(gè)接近半數(shù)致死量的濃度組的MT T結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果有較好的對(duì)應(yīng)性。其中最高濃度組(澤蘭水提液5 120 μ g/mL濃度組和95%乙醇洗脫液640 μ g/mL濃度組)凋亡明顯,鏡下觀察細(xì)胞大量死亡,存活細(xì)胞變形縮小,提示此藥物濃度已具有較強(qiáng)的毒性作用。澤蘭水提液2 560 μ g/mL濃度組及95%乙醇洗脫液 320 μ g/mL濃度組,雖然未見(jiàn)凋亡,但是與最高濃度具有的相似周期轉(zhuǎn)化趨勢(shì),鏡下觀察,細(xì)胞部分死亡或變形,細(xì)胞數(shù)目變少,提示此時(shí)已有一定的毒性作用。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明:澤蘭具有降血脂[8]、抗血小板聚集和抗血栓形成[9]等藥理作用。新近的研究顯示:澤蘭能抑制高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的炎癥反應(yīng)[10],這些環(huán)節(jié)都與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。以往的研究顯示,澤蘭具有抑制多種細(xì)胞增殖的作用。本實(shí)驗(yàn)初步得出澤蘭具有在體外抑制人堿性成纖維生長(zhǎng)因子、人表皮生長(zhǎng)因子刺激人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的活性,為澤蘭深入研究抗AS活性和機(jī)制以及開(kāi)發(fā)創(chuàng)新藥物提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但澤蘭抑制細(xì)胞增殖的具體作用機(jī)制尚不明確,有待于進(jìn)一步研究。

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