舒冠滴丸對高脂血癥大鼠缺血再灌注損傷心肌ICAM-1表達(dá)的影響

王建湘,程丑夫,鄧滿霞

許多研究表明,炎癥反應(yīng)參與了心肌缺血再灌注損傷(my- ocardial ischemia reperfusion injury,MIRI),其中中性粒細(xì)胞(PM N)浸潤是介導(dǎo)該炎癥反應(yīng)的主要媒介[1]。在再灌注早期(即＜1 h),大多PMN黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞并引起內(nèi)皮損傷,間接導(dǎo)致心肌損傷;隨著再灌注時(shí)間的延長,更多PMN移動到血管外并黏附在心肌細(xì)胞上,參與心肌細(xì)胞損傷。細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)在內(nèi)皮及心肌細(xì)胞中的誘生對PMN介導(dǎo)的缺血再灌注損傷至關(guān)重要[2]。ICAM-1通過誘導(dǎo)PMN黏附在內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮下基質(zhì)并穿過內(nèi)皮遷移流入缺血區(qū),通過阻塞微血管、釋放氧自由基等機(jī)制導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷,使梗死過程加劇。舒冠滴丸具有芳香通脈、益氣溫陽、豁痰化瘀功效,前期研究證實(shí)[3,4],舒冠滴丸能抑制內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1mRNA異常表達(dá),對高脂血清損傷的內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用;具有調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂,減少動脈內(nèi)膜斑塊數(shù)量,消退和穩(wěn)定動脈粥樣硬化(AS)斑塊,降低血漿sCD40L、可溶性細(xì)胞間黏附分子-1(sICAM-1)水平,其作用可能與抑制AS斑塊炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究擬建立高脂血癥大鼠心肌缺血再灌注損傷模型,觀察舒冠滴丸對缺血再灌注損傷心肌ICAM-1表達(dá)的影響,并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性Wistar大鼠,體重 180 g～200 g,由湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物合格證號:醫(yī)動字第20-007號,于清潔級飼養(yǎng)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品與試劑、儀器 舒冠滴丸由冰片、鵝不食草、丁香、肉桂、紅參、白芥子、三七等中藥制成滴丸,每粒 50 mg,由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供,批號:20061128,用 2×DMEM/F12稀釋成20 mg/mL,抽濾滅菌,4℃保存?zhèn)溆?辛伐他汀片,每片20 mg,由杭州默沙東制藥有限公司提供,批號:20080321;膽固醇、膽酸鈉(武漢亞法生物技術(shù)有限公司);甲基硫氧嘧啶(上海復(fù)星朝暉藥業(yè)有限公司);丙二醇(上海生物工程有限公司);小鼠抗人-ICAM-1單克隆抗體(Zymed公司,USA);SP試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉生物科技股份有限公司);總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(北京中生生物工程高技術(shù)公司);高速冷凍離心機(jī)(Beckman Allerga 25R);光學(xué)顯微鏡(江蘇凈化設(shè)備廠);CL-7200全自動生化分析儀(日本島津公司);HX-200動物呼吸機(jī)(成都太盟科技有限公司);Image-Pro Plus 4.5圖像分析系統(tǒng)(Olympus公司,Japan)。

1.3 大鼠高脂血癥模型的建立 根據(jù)文獻(xiàn)[5]的方法,健康雄性Wistar大鼠,在基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上,予配制的脂肪乳高脂飲食10 mL/(kg?d)連續(xù)灌胃14 d即可造成高脂血癥模型。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及處理 Wistar大鼠70只,隨機(jī)分成7組,每組10只。空白對照組:常規(guī)飼養(yǎng),不做任何處理;模型組:每天給予生理鹽水10 mL/kg灌胃;假手術(shù)組:手術(shù)措施同模型組,只穿線不結(jié)扎冠狀動脈,每天給予生理鹽水10 mL/kg灌胃;舒冠滴丸高劑量組:手術(shù)措施同模型組,每天給予舒冠滴丸250 mg/kg灌胃;舒冠滴丸中劑量組:手術(shù)措施同模型組,每天給予舒冠滴丸125 mg/kg灌胃;舒冠滴丸低劑量組:手術(shù)措施同模型組,每天給予舒冠滴丸50 mg/kg灌胃;陽性藥物對照組:手術(shù)措施同模型組,每天給予辛伐他汀5 mg/kg灌胃。高脂血癥大鼠不同處理因素持續(xù)灌胃14 d,末次給藥后1 h用于實(shí)驗(yàn)。

1.5 在體大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的建立 按文獻(xiàn)[6]方法,腹腔注射1%戊巴比妥鈉(4 mL/kg)麻醉。麻醉后仰臥位固定四肢及頭部于手術(shù)臺上,連接心電電極記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。行頸部正中切口分離氣管,穿線備用,氣管插管,連接小動物呼吸機(jī)(室內(nèi)空氣,潮氣量2 mL/100 g,呼吸頻率60/min)。于心尖搏動處縱行分離皮膚、肌層,剪斷2肋～4肋,分離心包膜,輕輕擠壓胸廓,暴露心臟,掀起左心耳,于左心耳根部下方肺動脈圓錐旁以5/0帶彎針尼龍縫線迅速穿過冠脈下方,將心臟放回胸腔。穩(wěn)定10 min后,提拉穿過小塑料管的縫線兩端,將塑料管壓向心肌表面,用止血鉗夾住小管及其中縫線以結(jié)扎冠脈造成心肌缺血,45 min后松開止血鉗以形成再灌流,120 min再灌注后結(jié)束實(shí)驗(yàn)。模型復(fù)制成功的標(biāo)準(zhǔn):結(jié)扎后Ⅱ?qū)?lián)心電圖以J點(diǎn)或ST段明顯抬高或QRS波增高、增寬與T波融合,呈弓背向上單向曲線為心肌缺血成功復(fù)制;放松結(jié)扎線后,抬高的ST段下降1/2以上為再灌注成功復(fù)制。

1.6 心肌組織HE染色 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,將大鼠立即處死取心,切取左心室于10%甲醛中常規(guī)固定,流水沖洗,經(jīng)各級乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片,HE染色,中性樹膠封片,于光鏡下觀察。

1.7 心肌組織ICAM-1免疫組化測定 取心肌組織標(biāo)本常規(guī)脫蠟至水,免疫組化染色采用S-P法,利用小鼠抗人ICAM-1單克隆抗體嚴(yán)格按文獻(xiàn)[7]報(bào)道方法和試劑盒說明書進(jìn)行心肌組織ICAM-1免疫組化測定,DAB顯色劑顯色,蘇木素輕度復(fù)染,中性樹膠封片。實(shí)驗(yàn)以PBS代替一抗進(jìn)行反應(yīng)作陰性對照。通過ALTA U2圖像采集卡采集圖像,Image Pro Plus 4.5圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行計(jì)算機(jī)圖像分析,統(tǒng)一參數(shù)設(shè)定保持基線一致,其陽性追蹤點(diǎn)為表達(dá)于胞漿或胞膜的棕黃色定位。每張切片隨機(jī)觀察10個視野,計(jì)算切片各視野陽性點(diǎn)面積總和及光密度均值,以陽性點(diǎn)面積總和/陽性點(diǎn)光密度均值表示陽性表達(dá)強(qiáng)度。

1.8 血脂檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前心臟取血2 mL,3 000 r/min離心15 min后取上清,-20℃保存,標(biāo)本收集結(jié)束后由CL-7200全自動生化分析儀測定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,各組間數(shù)據(jù)顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組缺血再灌注損傷大鼠心肌病理形態(tài)學(xué)變化 光鏡下見模型組心肌纖維排列紊亂,呈波浪狀,部分區(qū)域有斷裂,胞漿嗜酸性增強(qiáng),可見空泡樣變,心肌間質(zhì)嚴(yán)重水腫,有少量炎性細(xì)胞;辛伐他汀組心肌纖維排列基本整齊,空泡變性減輕,心肌間質(zhì)輕度水腫;舒冠滴丸組心肌細(xì)胞排列基本整齊,心肌纖維排列基本整齊,空泡變性減輕,心肌間質(zhì)水腫不明顯,炎細(xì)胞浸潤減少。辛伐他汀組病理改變與舒冠滴丸高劑量組相近。

2.2 各組大鼠心肌組織ICAM-1蛋白表達(dá)變化 模型組心肌組織ICAM-1蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01),說明MIRI使ICAM-1表達(dá)增強(qiáng)。與模型組比較,舒冠滴丸各劑量組ICAM-1蛋白表達(dá)量均降低(P＜0.05)。辛伐他汀組心肌ICAM-1蛋白表達(dá)量與舒冠滴丸高劑量組相近,空白組和假手術(shù)組比較,大鼠心肌ICAM-1蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 各組ICAM-1表達(dá)變化的比較(±s)

表1 各組ICAM-1表達(dá)變化的比較(±s)

組別 n ICAM-1空白組 10 103.35±155.72假手術(shù)組 10 105.47±156.45模型組 10 352.41±215.291)舒冠滴丸高劑量組 10 172.43±154.722)舒冠滴丸中劑量組 10 173.35±160.912)舒冠滴丸低劑量組 10 175.48±156.352)辛伐他汀組 10 175.21±156.832)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.05

2.3 各組大鼠血脂含量變化 與空白組比較,模型組血清TC、TG、LDL-C含量明顯升高(P＜0.01),HDL-C含量明顯下降(P＜0.01),表明大鼠高脂血癥模型復(fù)制成功。與模型組比較,舒冠滴丸高劑量和中劑量組可明顯降低血清TC、TG、LDL-C(P＜0.05),升高HDL-C(P＜0.05),舒冠滴丸低劑量組和模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);辛伐他汀組血脂與舒冠滴丸高劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);假手術(shù)組和模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表2。

表2 舒冠滴丸對MIRI大鼠血脂含量的影響(±s)mmol/L

表2 舒冠滴丸對MIRI大鼠血脂含量的影響(±s)mmol/L

組別 n TC TG HDL-C LDL-C空白組 10 5.29±0.59 0.56±0.03 1.62±0.05 1.05±0.07假手術(shù)組 10 11.23±1.05 1.67±0.06 0.86±0.17 1.64±0.02模型組 10 11.29±1.411) 1.69±0.021) 0.87±0.011) 1.63±0.011)舒冠滴丸高劑量組 10 7.91±1.672) 0.96±0.082) 1.28±0.022) 1.15±0.072)舒冠滴丸中劑量組 10 8.43±0.012) 1.08±0.082) 1.19±0.042) 1.24±0.042)舒冠滴丸低劑量組 10 10.27±0.18 1.41±0.05 0.91±0.13 1.45±0.03辛伐他汀組 10 7.74±0.022) 0.81±0.082) 1.33±0.042) 1.09±0.042)與假手術(shù)組比較,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.05

3 討 論

近年來,中性粒細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、白細(xì)胞的聚集在缺血再灌注損傷發(fā)生中的重要性已被認(rèn)識,特別是黏附分子的研究已受到廣泛重視。在心肌缺血再灌注期間有大量炎性細(xì)胞特別是中性粒細(xì)胞在微血管出現(xiàn)聚集乃至堵塞中斷血流,這是由于微血管內(nèi)皮細(xì)胞與炎性細(xì)胞發(fā)生黏附反應(yīng)的結(jié)果。ICAM-1又稱CD45,屬于免疫球蛋白超家族的一員,為19號染色體基因編碼的單鏈跨膜糖蛋白,其核心多肽分子量為55 000。它作為白細(xì)胞功能相關(guān)抗原、巨噬細(xì)胞分化抗原-1的配體,參與白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附并向血管外遷移,黏附心肌細(xì)胞釋放細(xì)胞毒,表達(dá)增強(qiáng)的ICAM-1還可反饋?zhàn)饔糜趦?nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞,促進(jìn)細(xì)胞因子等炎癥介質(zhì)的表達(dá)。國外研究發(fā)現(xiàn)[8],MIRI中ICAM-1表達(dá)明顯升高,且與心肌損傷密切相關(guān)。正常情況下,血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞僅表達(dá)極少量的ICAM-1,而在缺血再灌注時(shí),ICAM-1可在核轉(zhuǎn)錄因子-κ B(NF-κ B)、活性蛋白-1(AP-1)、白介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等作用下表達(dá)量成倍增加[9]。ICAM-1的高表達(dá)可刺激中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附,介導(dǎo)其對心肌細(xì)胞的浸潤,引起并加劇心肌細(xì)胞的損傷,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。有研究表明[10,11],心肌缺血1 h后再灌注1 h,在缺血心肌中可檢出ICAM-1mRNA,且隨再灌注時(shí)間延長而表達(dá)增加,而再灌注3 h,非缺血心肌仍無明顯ICAM-1mRNA表達(dá)。Niessen等[12]研究認(rèn)為AMI心肌細(xì)胞中ICAM-1高表達(dá),若抑制其表達(dá),可減小梗死面積。而應(yīng)用ICAM-1特異性抗體可以減少再灌注后的心肌損傷和心肌梗死面積[12]。本研究發(fā)現(xiàn),缺血45 min再灌注2 h后模型組心肌組織ICAM-1蛋白表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01),說明MIRI使ICAM-1表達(dá)增強(qiáng);與模型組比較,舒冠滴丸各劑量組ICAM-1蛋白表達(dá)量均降低(P＜0.05),提示其可以降低大鼠MIRI心肌ICAM-1蛋白表達(dá)量,減輕PM N浸潤,抑制其炎癥反應(yīng)。

高脂血癥是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一,是動脈粥樣硬化性疾病的重要病因。本研究通過改變動物的飲食習(xí)慣,成功地建立了食源性大鼠高脂血癥模型,并在此基礎(chǔ)上采用結(jié)扎冠脈左前降支的方法,制備成大鼠心肌缺血再灌注損傷模型,此動物模型的心電圖演變、心肌酶學(xué)改變及組織病理形態(tài)學(xué)變化均與人類發(fā)生急性心肌梗死接近[13],能高度模擬臨床冠心病的發(fā)生發(fā)展及治療過程,使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具有臨床指導(dǎo)意義。本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠血清 TC、TG、LDL-C的含量均明顯升高,而HDL-C顯著下降,說明模型組大鼠存在著血脂代謝紊亂,通過舒冠滴丸干預(yù)治療,結(jié)果顯示可以顯著降低高脂血癥模型大鼠血清 TC、TG、LDL-C的水平,明顯提高血清 HDL-C的水平,表明舒冠滴丸可有效地糾正高脂血癥大鼠的脂質(zhì)代謝紊亂。

[1]Dietrich R,Sylvia MS,Christian H,et al.Differential ex pression of chemokines,risk of stable coronary heart disease,and correlation with established cardiovascularrisk markers[J].Arterioscler T hromb Vasc Biol,2006,26(1):194-199.

[2]Merchant SH,Gurule DM,Larson RS,et al.Amelioration of ischemia reperfusion injury with cyclic peptide blockade of ICAM-1[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003,284(4):1260-1268.

[3]王建湘,程丑夫,尹樹忠.舒冠滴丸對高脂血清內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1mRNA表達(dá)影響的研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2008,6(5):536-537.

[4]王建湘,程丑夫,韓育明.舒冠滴丸對動脈粥樣硬化兔CD40通路調(diào)節(jié)作用研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2007,5(10):958-960.

[5]孫瀟,姜恩平,陳建光.北五味子總木脂素對高脂血癥大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2009,35(2):276-279.

[6]趙學(xué)忠,張志國,睢大員,等.福辛普利對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2005,31(4):567-570.

[7]Xu HX,Li GS,Li JJ,et al.Preliminary observation of reg ressive effect of losartan on atherosclerosis in the cholesterol-fed rabbits[J].Chin J Cardiol,2002,30(8):496-499.

[8]Yang XP,Irani K,Mattagajasingh S,et al.Signal transducer and activator of transcription 3alpha and specificity protein 1 interact to upregulate intercellular adhesion molecule-1 in ischemic-reperfused myocardium and vascularendothelium[J].A rterioscler Thromb Vasc Biol,2005,25(7):1-3.

[9]Sun B,Fan H,Honda T,et al.Activation of NF kappa B and expression of ICAM-1 in ischemic-reperfused canine myocardium[J].J Mol Cell Cardiol,2001,33(1):109-119.

[10]Youker KA,Hawkins HK,Kukielka G L,et al.Molecular evidence for induction of intracellular adhesion molecule-1 in the viable border zone associated with ischemia-reperfusion injury of the dog heart[J].Circulation,1994,89(6):36-46.

[11]Habazettl H,Hanusch,Kupatt C.Effects of endothelium/leukocytes,pltelet interaction on my ocardial ischemia reperfusion injury[J].Z Kardiol,2000,89(9):92-95.

[12]Niessen HW,Krijnen PA,Visser CA,et al.Intercellular adhesion molecule-1 in the heart[J].Ann NY Acad Sci,2002,97(3):573.

[13]Liu HR,Tao L,Gao E,et al.Anti-apoptotic effects of rosiglita zone in hy percholesterolemic rabbits subjected to myocardial ischemia and reperfusion[J].Cardiovasc Res,2004,62(1):135-144.