老齡與年輕大鼠腦出血后腦損傷神經缺失的研究

孟凡超 婁季宇

1)鄭州市第三人民醫院神經內科 鄭州 450000 2)鄭州大學第二附屬醫院神經內科 鄭州 450014

隨著世界人口老齡化,腦血管病(cerebrovascular disease,CVD)的發病率逐年升高,引起了世界各國人們的關注。有研究報道,在所有的腦血管疾病中,缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease,ICVD)發病率最高[1]。腦出血(Intracerebral hemorrhage ICH)是常見的致死性卒中類型,大多是老年性疾病,既往和目前的實驗性腦出血研究一直沿用年輕大鼠動物模型,有研究表明老齡是影響動物及人類缺血性腦損傷的重要因素[2-3]。但老齡是否影響腦出血后腦損傷,目前尚未見有人在動物模型方面進行系統研究。本研究觀察年齡對腦出血后腦損傷和神經功能缺失的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器 Narishige型立體定向儀(日本),微量進樣器(上海醫用激光儀器廠),顯微外科手術器械(上海醫療器械廠),神經評分器械(自制)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物與分組:(1)實驗動物的選擇 實驗動物選自河南省實驗動物中心提供的年輕3月齡和老齡16月齡雄性SD大鼠,體質量分別為280～350 g和600～680 g。(2)動物分組 年輕、老齡SD大鼠各 6只分別于6 h、12 h、24 h、72 h、7 d、14 d進行神經功能評分。

1.2.2 大鼠尾狀核腦出血模型建立和成功的標志 :采用改良的自體股動脈取血并腦內注射的方法。10%水合氯醛(400mg/kg)腹腔內注射麻醉;首先在操作臺上切開右股部皮膚,切口長10～15 mm,分離肌肉、神經,暴露股動脈后將大鼠俯臥位固定在立體定向儀上。按照包新民[4]等報道的定位方法,使上門齒鉤平面比耳間線平面低2.4 mm。調節定向儀使前后囟在同一水平面上,頭部正中切開皮膚,長約15 mm,3%雙氧水剝蝕骨膜,暴露前后囟門。于前囟前0.2 mm,中線右側旁開3.5 mm處齒科鉆鉆一直徑約1 mm的小孔,不傷及硬腦膜。微量注射器抽取100μl股動脈未凝血并局部壓迫止血,將微量注射器固定于立體定向儀上,自鉆孔處垂直進針,深度5.5 mm,以10μl/min速度向大鼠尾狀核內推注,推注完畢后留針10min,以免血液自針道反流,退針后,骨蠟封閉鉆孔,縫合切口。

1.2.3 動作測評實驗:所有動物均由不知情的實驗者在手術前后對神經狀況進行評分。模型成功后分別于術后6 h、12 h、24 h、72 h、7 d和 14 d對神經狀況進行評分 。

1.2.4 前肢放置試驗:使用撩拔觸須引發前肢放置而進行評分,每個前肢通過每次撩拔同側觸須引發同側肢體放置桌面的次數,每個前肢測10次。測定成功放置反應的百分數。對側前肢造成腦出血的一側成功放置反應降低。

1.2.5 前肢使用不對稱測驗:通過對放置于透明圓筒的大鼠錄相3～10min,依其在實驗中的活動程度,分析前肢在探索活動中的使用情況,前肢使用的幾率決定動作活動。非削弱前肢的使用幾率以其在筒壁上觀察到的肢體使用的百分數[I]表示;削弱前肢的使用幾率以其在筒壁上觀察到的肢體使用的百分數[C]表示;雙側前肢同時在筒壁上觀察到的肢體使用的百分數[B]表示,大體上單個肢體使用不對稱分數計稱為(I/I+C+B-C/I+C+B)。轉角試驗:讓大鼠進入一個帶30°角的轉角通道,大鼠能夠轉向左或右邊,在出口處記錄左、右轉的次數。每次試驗至少30 s,重復10～15次,計算右轉的百分數。

1.3 統計學處理 應用SPSS10.0統計軟件進行數據處理,所有數據均采用均數±標準差()表示,采用Student t檢驗,取α=0.05作為顯著性檢驗標準。

2 結果

動作測評實驗:采用前肢使用不對稱、前肢放置和轉角試驗評價動作行為缺失,大鼠自體全血注射后6 h～14 d進行檢查,實驗表明腦出血后經過24 h神經行為學上的缺乏,但進行性神經功能恢復在2周以上。初期的(24 h)動作行為缺失,經前肢放置得分評分、前肢使用不對稱得分評分,老齡與年輕大鼠比較差異明顯(圖1,2),老齡組這一差異可持續至腦出血后2周(圖1,2,3)。腦出血不影響同側的(未受損的)前肢放置。與另外的2組測試對比,腦出血后轉角試驗得分神經功能恢復的證據很少,得分接近百分之百,除14 d之外在老齡組之間得分沒有顯著的差異,在此之間老齡組大鼠有顯著的神經功能缺失(圖3)。

神經行為學的評定包括腦出血后年輕和老齡大鼠前肢使用不對稱(圖1)、前肢放置(圖2)和轉角試驗(圖3),實驗數據用均數±標準差()表示,與年輕大鼠比較*P＜0.05;#P＜0.01

3 討論

3.1 腦出血動物模型制作方法的選擇及其意義 利用立體定向手術向腦內注入膠原酶或自體血方法制作的腦出血動物模型與人類腦出血發病情況較接近,且出血量及出血部位的重復性較好,故應用較多。立體定向下向腦內植入可充脹的微氣囊常用于模擬腦出血的占位效應及手術清除血腫過程的研究。自發性腦出血動物模型具有類似人類高血壓動脈硬化的病理生理基礎,但出血量及出血區域無法控制,故應用極少。

腦內直接注入自體動脈血或凝血塊是最常用的腦出血模型。該模型適合于研究腦出血的占位效應、腦水腫及來自血管的活性物質等在腦損傷中的作用。關于動脈血的選擇,常用的有:(1)剪尾取血:其血液成份多為靜脈血和小部分動脈血,也有組織液,成份復雜,與臨床丘腦出血是動脈破裂出血的血液內容不符;(2)尾動脈取血:手術創傷小,不影響大鼠肢體的功能,使行為學評分更準確;取血成功率較難控制。(3)股動脈取血:股動脈血作為供血動脈,取血成功率較高;但是手術創傷,影響取血下肢功能,使對大鼠的下肢行為學觀察困難。

目前仍缺乏既有類似人類高血壓、動脈硬化的病理生理基礎,又較接近人類腦出血發病情況,并且出血量及出血部位均有較好重復性的腦出血動物模型。腦出血恢復期的動物模型則更加缺乏。況且目前大多數實驗性腦出血模型使用的是年輕動物,而腦出血大多是老年性疾病,這一模型缺乏老年狀態下的腦出血病理基礎,不能較完備地模擬臨床疾病過程。已有實驗證明[5],年齡在其他腦損傷形式中是非常重要的因素,影響小膠質細胞和星形膠質細胞的活化及可塑性。老齡是否影響腦出血后腦損傷,目前尚未見有人在動物模型方面進行系統研究。本實驗動物模型的制作是Hua[6]等方法,用年輕(3個月齡)和老齡(16個月齡)雄性 SD大鼠自體股動脈全血100μl注入尾狀核制作腦出血動物模型,然后觀察與年齡相關的神經缺失的變化。設想年齡因素對腦出血后腦損傷及其損傷后的神經功能恢復具有重要影響,探討年齡對腦出血后腦損傷機制的影響,從而可能為制做合理的腦出血動物模型尋找新途徑。

3.2 腦出血損傷與神經行為學改變 腦出血后24 h神經功能缺失,但進行性功能恢復需在2周以上,初期的(24 h)動作行為缺失,經過前肢放置得分評分、前肢使用不對稱得分評分進行評價,老齡與年輕大鼠比較差異明顯(圖1,2),老齡組這一差異持續腦出血后2周(圖1,2,3),腦出血不影響同側的(未受損的)前肢放置。與另外的2組測試對比,腦出血后轉角試驗得分神經功能恢復的證據很少,得分接近百分之百。在老齡組之間除14 d之外得分沒有顯著的差異,在此之間老齡組大鼠有顯著的神經缺失。腦出血后神經功能恢復依賴于大腦可塑性。大腦可塑性并不是簡單的形態學改變,而是存在于整個生命過程的多種變化,有多種腦細胞參與,包括神經細胞、神經膠質細胞及大腦中的血管內皮細胞等。健康人的皮質代表區會因為訓練和運動技巧的獲得而發生修飾,類似的神經修飾同樣也可由神經系統的損傷所引發[7]。這種神經系統可隨環境改變而發生適應性變化的特性稱為可塑性[8]。從1930年Bach提出腦的可塑性理論至今,有關腦可塑性的理論有替代論、遠隔功能抑制論、神經發芽論、突觸功能調整論、神經再生微環境變化論[9],這些理論各有側重地闡述了大腦損傷后功能恢復可能的機制。不同年齡的人或動物其大腦可塑性是不一樣的,具有很明顯的“年齡依賴性”。腦出血后神經缺失起源于損傷與修復的平衡,有研究表明腦出血后時間依賴性的神經功能恢復很可能源于其可塑性[10],研究表明老齡神經功能可塑性程度普遍的降低[11]。因此,老齡動物更多的神經缺失可能反應最初的損傷或神經功能恢復能力的變化,老齡動物腦出血的效應可能由早期損傷和神經功能恢復能力衰減的復合作用而加重。總之,澄清年齡對腦出血后腦損傷的影響有助于為出血性腦損傷制定新的治療策略。

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