胰島素對缺氧/復氧神經元上的HMGB1、NF-κB表達的影響

周艷麗 滕軍放 婁季宇

1)鄭州市第十人民醫院 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052 3)鄭州大學第二附屬醫院神經內科 鄭州 450014

近年來研究發現In除了發揮調節血糖的作用外,對缺血性腦血管病腦損傷有保護作用,但其作用機制尚未完全明了。本實驗擬通過體外培養神經元,以缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模擬缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI),觀察 In對神經元凋亡、HMGB1和 NF-κB表達的影響,探討In對中樞神經系統保護的作用機制,為其治療急性缺血性腦血管病提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 出生24h內的SD大鼠(鄭州大學動物中心);抗NSE、抗NF-κB、抗 HMGB1多克隆抗體(博奧森);TUNEL檢測試劑盒(Roche);SP免疫組化試劑盒(博奧森);正規胰島素注射液(上海第一生化)。

1.2 原代大鼠皮質神經元的培養與鑒定 采用Lee JM的方法[1]:取新生SD大鼠腦組織制成細胞懸液,接種在24或96孔板中培養。7d后用NSE抗體進行細胞免疫組化染色,計數陽性神經元達85%以上符合實驗要求。

1.3 實驗分組 將培養7d的神經元隨機分為3組。A組:將培養液換為有糖 Earle's液后培養;B組:單純 H/R,將培養液換為無糖Earle's液放入缺氧袋中,通入95%N2+5%CO2后繼續培養;C組:予1mU/L的In預處理1h后再予H/R。50min后以上 3組重新換回正常培養基,繼培養 24h。分別于復氧后 0、3、6、12、24h各時間點檢測凋亡神經元、HMGB1和 NF-κB的表達。單純 H/R模型成功標準:H/R 0、24h MT T檢測細胞存活率,分別下降至 90%、60%以下。

1.4 TUNEL法檢測凋亡細胞 嚴格按照說明書操作。用已知的陽性圖片做陽性對照,陰性對照采用試劑盒中2液代替反應液。陽性凋亡細胞被染為棕黃色。光學顯微鏡下,每個培養孔隨機選取3個不連續的視野,計數200個細胞中染色的細胞數。

1.5 細胞免疫組化檢測HMGB1和NF-κB的表達 嚴格按照說明書操作。用已知的陽性圖片做陽性對照,陰性對照采用PBS液代替一抗。HMGB1陽性細胞胞漿被染為棕黃色,NF-κB陽性細胞胞核被染為棕黃色。光學顯微鏡下,每個培養孔隨機選取3個不連續的視野,計數200個細胞中染色細胞的數。

1.6 統計學方法 采用SPSS 10.0軟件分析,數據以表示,多組間計量資料比較采用隨機測量的方差分析。用LSD-t檢驗進行兩兩比較,α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 培養7d神經元NSE鑒定 陽性率為(91.70±3.60)%。

2.2 各組大鼠皮質神經元凋亡數目 見表1。

表1 各組大鼠皮質神經元凋亡數目比較 ()

表1 各組大鼠皮質神經元凋亡數目比較 ()

與A組比較,★P＜0.05;與B組比較,☆P＜0.05

2.3 各組大鼠皮質神經元HMGB1的表達 見表2。

表2 各組大鼠大腦皮質神經元HMGB1胞漿表達的比較 ()

表2 各組大鼠大腦皮質神經元HMGB1胞漿表達的比較 ()

與A組比較,★P＜0.05;與B組比較,☆P＜0.05

2.4 各組大鼠皮質神經元NF-κB的表達 見表3。

表3 各組大鼠皮質神經元NF-κB胞核表達的比較 ()

表3 各組大鼠皮質神經元NF-κB胞核表達的比較 ()

與A組比較,★P＜0.05;與B組比較,☆P＜0.05

組別 n 0h 3h 6h 12h 24h A 組 15 37.87±10.97 38.27±6.83 39.47±10.95 37.47±9.68 38.67±8.42 B組 15 41.47±9.29 56.67±10.76★ 71.47±14.41★ 86.07±12.43★ 85.93±13.19★C組 15 41.21±8.11 41.33±9.10☆ 42.45±10.24☆ 42.77±10.54☆ 43.25±12.80☆F值 0.52 17.71 22.29 66.18 65.53 P＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

Goldberg MP等[2]的方法能很好的模擬腦IRI,本實驗依據此建立體外神經元IRI模型。

In已廣泛應用于臨床,在糖尿病治療中發揮著及其重要的作用。近年來研究表明[3]胰島素還可減輕缺血性腦損傷,該作用獨立于它的降血糖作用之外。In能使缺血性腦卒中缺血半暗區血流增加,Ca2+超載減輕,興奮性氨基酸及NO的毒性作用抑制;增強腦源性神經生長因子作用;可通過PI3K/Akt途徑使JNK1/2、Caspase-3等的表達下調,Bcl-2表達上調而抑制神經細胞凋亡,起到腦保護作用。本研究發現,與A組相比,B組H/R后3h凋亡細胞增多,并隨著H/R時間的延長逐漸增多,提示缺血再灌注導致了神經元凋亡,這與腦缺血再灌注后神經細胞發生凋亡的規律基本一致。C組應用In預處理后,發現凋亡細胞較B組明顯減少。這提示In可抑制細胞凋亡,減輕缺血再灌注對神經元的損傷。

HMGB1是一種非組蛋白DNA結合蛋白,近期研究發現HMGB1在IRI中起重要作用。有動物實驗[4]觀察到HMGB1在腦缺血再灌注中由損傷和壞死的神經元胞核中轉移至胞漿再釋放至胞外,導致神經元的壞死和凋亡,抗-HMGB1單克隆抗體可縮小梗死區域,減輕腦損傷。本實驗發現,B組神經元胞漿HMGB1表達較A組顯著增加,C組應用In預處理后神經元胞漿HMGB1表達明顯減少,提示In可抑制神經元HMGB1的胞漿表達,從而減輕神經元凋亡損傷。

NF-κB是一種真核轉錄因子,靜息狀態是存在于細胞質中,激活后移位至胞核與DNA結合產生一系列生物學作用。研究表明NF-κB持續激活后可通過調控細胞周期、促進細胞因子釋放、誘導促凋亡基因的表達等導致神經元凋亡[5]。本實驗發現,與A組相比,B組神經元胞核NF-κB表達明顯增加;C組應用In預處理后神經元胞核NF-κB表達較B組明顯減少;提示In可通過下調神經元NF-κB的胞核表達減少神經元凋亡。

綜上In可減輕H/R所致神經元凋亡,對腦IRI有保護作用,機制之一可能與抑制神經元 HMGB1的胞漿表達和NF-κB的胞核表達有關。

[1]Lee JM,Shih AY,Murphy T H,et al.NF-E2-related factor-2 mediates neuroprotection against mitochondrial complex I inhibitors and increased concentrations of intracellular calcium in primary cortical neurons[J].J Biol Chem,2003,278(39):37948-37956.

[2]Goldberg MP,Choi DW.Combined oxygen and glucose deprivation in cortical cell culture:calcium-dependent and calciumindependent mechanisms of neuronal injury[J].Neurosci,1993,13(8):3510-3524.

[3]Hui L,Pei DS,Zhang QG,et al.The neuroprotection of insulin on ischemic brain injury in rat hippocampus through negative regulation of JNK signaling pathway by PI3K/Akt activation[J].Brain Res,2005,1052(1):1-9.

[4]Liu K,Mori S,Takahashi HK,et al.Anti-high mobility group box 1 monoclonal antibody amelio rates brain infarction induced by transient ischemia in rats[J].T he FASEB Journal,2007,21(14):3904-3916.

[5]李軍,婁季宇,張磊.雌激素對大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織NF-κB表達和細胞凋亡的影響[J].中國實用神經病雜志,2007,10(3):100-102.

[6]Aoki E,Yano R,Yokoyama H,et al.Role of nuclear transcription factor kappa B(NF-kappaB)for MPTP(1-methy l-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahy ropyridine)-induced apoptosis in nigral neurons of mice[J].Exp M ol Pathol,2009,86(1):57-64.