原發性膽汁性肝硬化患者抗gp210抗體與核膜型抗核抗體的檢測及其臨床意義

姜慧英,劉 妍

(1.北京京煤集團醫院,北京102300;2.北京佑安醫院,北京100069)

原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)是一種慢性漸進性膽汁淤積性肝臟疾病,組織學是以破壞小膽管為其特征的非化膿性炎癥,并以血清中出現特征性自身抗體為其主要標志?？咕€粒體抗體(AMA)是PBC高敏感性血清學指標[1],ANA也在部分PBC患者中出現,在核膜型ANA的患者中發現三種自身抗體,即核心蛋白gp210抗體、核心蛋白p62抗體及核纖層蛋白B受體抗體[2]。本研究小組總結了抗gp210抗體與核膜型抗核抗體在PBC患者中的意義。

1 材料與方法

1.1實驗對象以北京佑安醫院1999-2006年期間收治確診的100例PBC患者作為研究對象。診斷標準:采用2000年美國肝病學會PBC指導建議[3]。60例AIH患者、50例 HBV患者和50例HCV患者作為疾病對照組,血庫隨機抽取50例獻血員作為正常對照。AIH采用1999年國際AIH小組制定的診斷標準[4]結合評分系統,病毒性肝炎按照2000年“病毒性肝炎防治方案”診斷[5]。

1.2方法(1)間接免疫熒光法檢測自身抗體(ANA、AMA、SMA、LKM、SLA/LP、LC-1):主要步驟為選擇 HEP-2細胞和5種組織的冰凍切片作為抗原,采用生物薄片技術將6種切片組合成一個反應區。待檢血清自1∶100起稀釋,與組織細胞孵育30分鐘;加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗體結合30分鐘;洗片、封片后熒光顯微鏡觀察結果。組織細胞內出現特異性綠色熒光、血清稀釋度＞1∶100為陽性。予以檢測抗核抗體(ANA)、抗線粒體抗體(AMA)、抗平滑肌抗體(SMA)和抗肝腎微粒體抗體(LKM)等自身抗體。(2)免疫印記法(EUROLINE)檢測gp210抗體:將膜條放入溫育槽中,每槽加1.5 ml標本緩沖液,在搖床溫育5 min,倒掉槽內液體。血清1∶100稀釋后加入溫育槽中在搖床溫育30 min后倒掉槽內液體,在搖床上用1.5 ml洗液清洗膜條3次,每次5 min。在槽中加入1.5 ml已稀釋酶結合物,在搖床上溫育30 min,倒掉槽內液體。洗液清洗膜條。槽中加入1.5 ml底物,在搖床溫育10 min,用蒸餾水清洗。將膜條置于結果判定模板中用免疫印記掃描儀讀取。所有試劑均采用德國EUROIMMUN實驗免疫試劑盒。

1.3統計學處理統計軟件采用SPSS軟件,計數資料采用行×列χ2檢驗,計量資料采用獨立樣本 t檢驗。

2 結果

2.1100例PBC患者自身抗體特點ANA陽性60例(60%),滴度從 1∶100-1∶3 200不等:其中核膜型 35 例,核點型13例,著絲點型10例,核點合并核膜型2例。AMA陽性100例。3例SMA陽性。gp210陽性33例,gp210陰性67例。

2.2gp210陽性組與陰性組ANA滴度及核型比較(1)gp210陽性組與陰性組ANA滴度比較:gp210陽性組:ANA陽性33例(1∶100-1∶3 200不等),AMA均陽性;gp210陰性組:ANA陽性27例(1∶100-1∶3 200不等),ANA陰性40例,27例中1例SMA陽性。陽性組與陰性組ANA滴度比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。(2)gp210陽性組與陰性組ANA核型比較:gp210陽性組ANA核型分析:30例(90.9%)表現核膜型,2例核膜合并核點型,1例著絲點型。gp210陰性組ANA核型分析:核點型13例(19.4%),9例著絲點型(13.4%),5例核膜型。見表2。

表1 gp210陽性組與陰性組ANA滴度比較(例,%)

表2 gp210陽性組與陰性組ANA核型比較(例,%)

2.3PBC、AIH、HBV、HCV、BD各組gp210陽性數及陽性率

100例PBC患者中,gp210陽性率為33%,明顯高于AIH患者的陽性率(13%),而HBV、HCV、BD各組gp210陽性率均為0。(見表3)

表3 PBC、AIH、HBV、HCV、BD各組gp210陽性數及陽性率比較

2.4PBC、AIH、HBV、HCV、BD各組ANA陽性數及核膜型ANA例數比較(見表4)

表4 PBC、AIH、HBV、HCV、BD各組 ANA陽性數及核膜型ANA例數比較

2.5gp210陽性組與陰性組生化指標比較(1)gp210陽性患者與陰性患者一般資料比較:33例gp210陽性患者與67例gp210陰性患者,兩組男性與女性比例分別為5∶11和20∶64,兩組均以女性發病為主。gp210陽性患者組發病年齡33-70(56.9±10.62)歲,gp210陰性患者組發病年齡34-84(54.24±12.45)歲,兩組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。gp210陽性組與陰性組患者,兩組患者發病年齡分布比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。(2)gp210陽性患者與陰性患者生化指標比較:gp210陽性患者與陰性患者 ALT、AST、Tbil、GGT、ALP、IgG、IgA、IgM 水平差異均無統計學意義(P＞0.05),見表5。(3)gp210陽性患者與陰性患者肝硬化發生率比較:gp210陽性患者肝硬化發生率(28/33例,84.8%)明顯高于陰性患者(33/67例,49.3%)(P＜0.01)。

表5 gp210陽性患者與陰性患者生化指標比較(s)

表5 gp210陽性患者與陰性患者生化指標比較(s)

組別 例數 ALT(U/L)AST(U/L)Tbil(umol/l)GGT(U/L)ALP(U/L)IgG(g/l)IgA(g/l)IgM(g/l)陽性 33 61.9±10.2 70.8±43.5 5.57±8.9 181±105 245±115.5 20.4±10.5 3.98±1.8853.56±2.440陰性 67 154±130 145.8±136.84.82±6.8 265±301 244±192.9 16.9±6.34 3.49±1.6774.32±2.604 P值 0.087 3 0.131 2 0.391 2 0.193 0.195 0.098 9 0.127 0 0.187

3 討論

近年來,隨著自身抗體檢測水平的不斷提高,我國PBC的發病率呈上升趨勢,因此對PBC的早期發現和臨床診斷顯得尤為重要。AMA、M2是目前公認的診斷PBC重要的血清學指標,部分PBC患者會出現高滴度ANA,PBC患者ANA滴度及其核型是否對PBC的診斷有意義成為我們研究的焦點。由于AMA-M2指標對PBC的診斷存在一定的局限性,少部分PBC患者AMA陰性,因此本課題小組用免疫印記法檢測了100例PBC患者的自身抗體,其中包括Ko、Ro-52、SLA/LP、LC-1、LKM-1、gp210、PML、Sp100、3E(BPO)等多種自身抗體,現選擇抗gp210抗體進行了分析。

本研究在100例PBC患者中檢測到33例gp210陽性,疾病對照組60例AIH患者中8例gp210陽性,對這8例患者的臨床資料重新評價后發現其中4例為PBC/AIH重疊綜合征,另4例是否是AMA陰性的PBC患者有待追蹤,而HBV、HCV、BD組gp210均陰性,因此可以推斷抗gp210抗體是PBC特異性自身抗體,和國內[6]、國外[7]的研究結論相符。

象其他自身免疫性疾病一樣,部分PBC患者除出現AMA外也可出現ANA,利用間接免疫熒光法,ANA可出現多種熒光模式:核點型、核膜型、均質型、著絲點型、核仁型等。本研究提示gp210陽性組與陰性組ANA滴度比較差異無統計學意義,但gp210陽性組與陰性組ANA核型比較有明顯差異:gp210陽性組主要表現核膜型(90.9%),其次 2/33(6.1%)表現核膜合并核點型,1/33表現著絲點型;而gp210陰性組19.4%表現核點型,13.4%表現著絲點型,7.5%表現核膜型。推斷核膜型ANA是PBC特異性核型。

表現為核膜型熒光染色型的抗核包膜蛋白抗體包括抗gp210、p62、抗核板層B受體抗體等?？筭p210抗體的靶抗原為位于核孔復合物上的210kD跨膜糖蛋白,所識別的表位是gp210羧基末端上的15個氨基酸殘基。從表4結果來看,100例PBC患者中60例出現ANA,并且30例(50%)為核膜型ANA,而60例AIH患者中盡管ANA出現的比例高,但是核膜型ANA只有4例,這4例重新評價臨床資料后為AIH/PBC重疊綜合癥,HBV、HCV、BD組沒有ANA的出現,說明核膜型ANA是PBC特異性自身抗體核型。Luettig等研究者[7]對因PBC而進行肝移植手術患者的隨訪中,發現患者在移植術后盡管ANA的滴度明顯下降,但是血清中ANA卻持續存在而且ANA的免疫熒光反應模式也未改變。進一步提示核膜型ANA是特異性自身抗體,在病變靶器官去除的情況下該抗體仍然存在。

抗gp210抗體不僅可與抗線粒體抗體同時出現,文獻報道抗gp210抗體也存在于20%-47%AMA陰性的PBC患者中[8],對于臨床、生化和組織學表現疑似PBC而AMA陰性的患者,或AMA陽性而臨床癥狀不典型、存在重疊綜合征(如與干燥綜合征重疊)的患者,抗gp210抗體檢測有重要價值。另外gp210陽性患者肝硬化發生率明顯高于陰性患者(P＜0.01),因此該抗體陽性提示患者預后不良,抗gp210抗體可作為PBC患者的預后指標。所以測定gp210抗體并結合ANA熒光模式可以提高PBC的診斷率。我們收集的PBC患者AMA均陽性,因此我們有待增加這部分病例資料。

隨著檢測手段的提高,越來越多新的自身抗體被發現,自身抗體的聯合檢測將使更多的PBC患者得到早期診斷和正確治療。

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