急性冠脈綜合征患者CD4+CD28-T細胞對內皮細胞的溶解作用

黃立娟,宋 輝,孫文杰

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院檢驗科,黑龍江哈爾濱150086)

急性冠脈綜合征(ACS)是以冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂或侵蝕,繼發完全或不完全閉塞性血栓形成的一組臨床綜合征。近年來在ACS患者的粥樣斑塊和外周血中發現了CD+CD28-T細胞,并認為CD+CD28-T細胞在ACS患者斑塊破裂中可能具有直接的作用。因此研究CD+CD28-T細胞對探討其在ACS患者斑塊破裂中的作用具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 研究對象

(1)急性冠脈綜合癥(ACS)組:臨床上選擇符合ACS診斷標準的患者30例。根據心絞痛發作性質、持續時間、程度,以及 CK-MB、TnI檢查診斷為不穩定心絞痛或急性心肌梗死。所有患者均行冠狀動脈造影檢查證實有冠狀動脈疾病。(2)穩定型心絞痛(SAP)組:選擇有典型的勞累性胸痛,休息或含服硝酸甘油后緩解的患者30例,所有患者至少一個主要冠狀動脈50%以上的狹窄,且沒有全身性炎癥或心肌炎癥。(3)正常對照組:健康體檢者20例,無冠狀動脈疾病病史,并經常規心電圖及實驗室檢查確認無心腦血管等疾病。

1.2 實驗方法

1.2.1主要試劑和設備 FITC-CD28 mAb,PerCPCD3 mAb,PE-CD4 mAb,PE-CD28 mAb,PerCP-CD4 mAb和PHA-P(美國Biolegend公司),FITC-anti-human CD161 mAb(美國Ancell公司),CD4 Negative Isolation Kit(Dynal Biotech USA),Postive Selection Human FITC Selection Kit(Empty Roboccp Stemcell),乳酸脫氫酶(LDH)釋放法定量檢測試劑盒(上海勁馬生物技術有限公司)。磁極(Easyse),流式細胞儀(美國BD公司FACSort),酶標儀(美國BD公司)。

1.2.2外周血CD+CD28-T細胞數量測定 實驗設實驗管和對照管。實驗管和對照管分別加入新鮮全血 100 μ l。實驗管加入 20 μ l PerC-CD3 mAb,PECD4單抗和FITC-CD28 mAb,對照管加入20 ml同型對照抗體,混勻,室溫避光孵育30 min,加入紅細胞裂解液,1 000 r/min離心5 min,棄上清。用PBS洗滌,1 000 r/min離心5 min,棄上清,用1%多聚甲醛PBS固定10 min。流式細胞儀分析CD+CD28-T細胞的白分比。

1.2.3外周血CD+CD28-T細胞表達CD161的檢測 實驗設實驗管和對照管。實驗管和對照管分別加入新鮮全血 100 μ l,實驗管加入 20 μ l PerCP-CD4 mAb,PE-CD28 mAb和FITC-CD161 mAb,對照管加入20μ l同型對照抗體,后面步驟同上。用流式細胞儀分析CD+CD28-和CD4+CD28+細胞CD161的表達。

1.2.4CD+CD28-T細胞克隆表達CD161測定

1.2.4.1分離CD+CD28-T細胞和CD4+CD28+T細胞采靜脈血(EDTA抗凝)50 ml,用免疫磁珠分選法分離CD+CD28-T細胞和CD4+CD28+T細胞。按說明書操作。用流式細胞儀對CD+CD28-T和CD4+CD28+T細胞純度進行鑒定,方法同CD+CD28-T細胞的測定。

1.2.4.2CD+CD28-T和CD4+CD28+T細胞克隆采用有限稀釋法將免疫磁珠法分離到的CD+CD28-和CD4+CD28+T細胞分別進行克隆,在克隆好的CD+CD28-和CD+CD28-T細胞懸液加入IL-12,調整培養液的濃度,IL-12終濃度為20 μ/ml,培養48小時。

1.2.4.3CD+CD28-細胞克隆CD161表達的測定具體操作同外周血CD161測定。用流式細胞儀分析CD+CD28-和 CD4+CD28+T細胞刺激前后CD161的表達。

1.2.5CD+CD28-T細胞溶解內皮細胞的功能 用乳酸脫氫酶釋放法

1.2.6統計結果處理 用SPSS軟件分析,實驗數據以均數±標準差來表示,采用兩組間資料的t檢驗分析,P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 急性冠脈綜合征患者外周血CD+CD28-T細胞的數量

正常對照組、SAP組和ACS組的CD4+CD28-T細胞的數量見表1。可以看出ACS組CD4+CD28-細胞比例比正常對照組和SAP組顯著增加(P＜0.05)。

表1 外周血 CD+CD28-T細胞數量(%,s)

表1 外周血 CD+CD28-T細胞數量(%,s)

注:*與正常對照組,SAP組比較P＜0.01

分組 正常對照組(n=20)SAP組(n=30)ACS組(n=30)CD+CD28-T 1.75±1.55 3.64±1.33 15.55±5.76*

2.2 急性冠脈綜合征患者外周血CD+CD28-T細胞表達CD161

實驗結果顯示,ACS組CD+CD28-T細胞CD161的表達顯著高于CD4+CD28+T細胞CD161的表達(圖1)。

2.3 IL-12刺激后CD+CD28-T細胞克隆CD161的表達

實驗結果顯示,未加IL-12刺激細胞克隆后的CD+CD28-和CD4+CD28+細胞都不表達CD161。而用IL-12刺激細胞克隆后,CD+CD28-細胞高表達CD161,CD4+CD28+細胞幾乎不表達CD161(圖2)。

2.4 CD+CD28-T細胞對內皮細胞的殺傷能力

效靶比為5∶1時,CD+CD28-T細胞對內皮細胞的殺傷活性(43.32±2.32)%顯著高于CD4+CD28+T細胞對內皮細胞的殺傷活性(4.98±0.45)%值(P＜0.01)。效靶比為20∶1時,CD+CD28-T細胞對內皮細胞的殺傷活性(51.31±3.12)%顯著高于CD4+CD28+T細胞對內皮細胞的殺傷活性(5.01±0.33)%值(P＜0.01)。與CD4+CD28+T細胞相比,CD+CD28-T細胞隨著效靶比增高殺傷活性明顯增強(P＜0.05)(表2)。

圖1 外周血CD+CD28-T細胞表達CD161的情況

圖2 CD4+CD28+T細胞和CD+CD28-T細胞克隆CD161的表達

表2 CD+CD28-T對內皮細胞殺傷作用(%,s)

表2 CD+CD28-T對內皮細胞殺傷作用(%,s)

注:*與CD4+CD28+組比較(comparation with CD4+CD28+group)P＜0.01

分組 5∶1 20∶1 CD4+CD28+T組 4.98±0.45 5.01±0.33 CD+CD28-T組 43.32±2.32* 51.31±3.12*

3 討論

多數研究表明在強直性脊柱炎、類風濕性關節炎、多發性硬化癥等自身免疫性疾病中CD+CD28-T細胞顯著增高[2-4]。血液淋巴細胞的激活,炎性因子的增多和內皮細胞間的炎性細胞反應造成急性冠脈綜合征患者免疫系統的異常,這在ACS的發病機制中起重要作用[5,6]。Chapman等[7]對CD+CD28-淋巴細胞特性進行了研究,發現在缺乏CD28信號時,能被抗CD3單抗激活并產生高水平的炎性細胞因子IL-2和 IFN-γ,提示CD+CD28-T淋巴細胞是一種促炎性反應細胞。本研究發現,CD+CD28-T淋巴細胞在急性冠脈綜合征患者外周血中異常增多,提示ACS的發生發展可能與CD+CD28-T淋巴細胞亞群的作用密切相關。

本研究結果顯示外周血CD+CD28-T細胞顯著高于正常對照組和穩定性心絞痛組。同時檢測了CD+CD28-T細胞是否表達CD161。研究結果表明,CD161在ACS患者外周血CD+CD28-T細胞上的表達顯著高于在CD4+CD28+T細胞上的表達。這說明缺失了CD28分子的CD4+T細胞獲得了另一種新的表達,具有同NK細胞相同的表面標志。而未用IL-12刺激細胞克隆的 CD+CD28-T細胞不表達CD161,用IL-12刺激細胞克隆后的CD+CD28-T細胞高表達CD161。這種現象說明在ACS患者體內的CD+CD28-T細胞是受某種因素刺激而獲得了CD161的表達,使得該細胞在體內處于活化狀態。

用CD4+CD28+T細胞和處于活化狀態的CD+CD28-T細胞分別與臍靜脈內皮細胞共培養,檢測兩種細胞對內皮細胞的溶解能力。結果表明,CD+CD28-T對內皮細胞有很高的溶解作用,顯示出很強的細胞毒功能,而CD4+CD28+T細胞沒有這種功能。在增加效靶比后,CD+CD28-T細胞溶解內皮細胞的作用增強,而CD4+CD28+T細胞的作用無變化,這說明內皮細胞的損傷程度與CD+CD28-T細胞濃度有關。因此,ACS患者體內異常的CD+CD28-T細胞增高以及增高的程度可能與疾病的嚴重性有關。

綜上所述,CD+CD28-T細胞可能通過不同途徑對內皮細胞產生殺傷作用。本研究證實了急性冠脈綜合征患者增多的CD+CD28-T細胞在體內處于活化狀態,具有細胞毒活性,這種細胞毒活性對血管內皮細胞有溶解作用,從而導致粥樣斑塊下內皮糜爛,引起斑塊破裂,造成急性事件的發生。這一研究為臨床在治療和預防ACS提供了新的思路,具有十分重要的意義。

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