人成骨肉瘤細(xì)胞系MG-63“Holoclone”樣單克隆的分離及其成骨分化程度的鑒定

孫樹東,婁 楠,王 巖,趙建武

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院骨科,吉林長春130041;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院骨科;3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院基因診療中心)

骨肉瘤無論從臨床角度還是分子生物學(xué)角度來講都是一個(gè)異質(zhì)性的腫瘤,而其一直就采用間充質(zhì)的分化標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行分級。盡管目前在醫(yī)學(xué)研究和外科手術(shù)上都取得了長足的進(jìn)步,但對于高危骨肉瘤的死亡率仍然停滯在30%到50%,而如何針對其近年來已有學(xué)者通過骨肉瘤的研究,使用單細(xì)胞克隆篩選的方法,以圖得到高侵襲,高致瘤的細(xì)胞亞群。而我們采用先分離得到holoclone后通過多個(gè)成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物的檢測,得到高侵襲及高致瘤的骨肉瘤細(xì)胞株。并對這些骨肉瘤細(xì)胞株進(jìn)行了一系列的鑒定試驗(yàn)。而通過觀察我們發(fā)現(xiàn)能夠形成“holoclone”的惡性腫瘤細(xì)胞是腫瘤中的真正致瘤部分,而這些細(xì)胞株形成的克隆更小,具有很高的克隆形成能力和更強(qiáng)的粘附能力[1,2]。其成骨分化標(biāo)志物表達(dá)更趨近于未分化狀態(tài)。

1 材料和方法

1.1 材料

人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63購自ATCC。高糖DMEM(H-DMEM)Gibico USA優(yōu)等胎牛血清(FBS)Hyclone USA胰酶Promega USA DMSO天佳生物科技有限公司China DEPC鼎國生物科技有限公司China Trizol InvitrogenUSA TaKaRa RT-PCRKit TaKaRa Japan Marker 1500 Takara Japan Taq DNA聚合酶TAKARA Japan CCk-8碧云天生物研究所CHINA

1.2 克隆篩選

采用有限稀釋法,將對數(shù)生長期的骨肉瘤MG-63細(xì)胞在96孔板中稀釋成每孔含0.5-1個(gè)細(xì)胞,在克隆化后3-5 d選出僅含有單個(gè)細(xì)胞生長的并生長成完全克隆的孔進(jìn)行標(biāo)記,待細(xì)胞增殖至孔面積1/3時(shí)(即細(xì)胞數(shù)超過600個(gè)),將細(xì)胞移至24或48孔板中擴(kuò)大培養(yǎng),后再轉(zhuǎn)至6孔板,最后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶,后行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)鑒定。

1.3 生物學(xué)特性鑒定

1.3.1形態(tài)學(xué) 相差顯微鏡拍攝有限稀釋法分離得到的各單克隆細(xì)胞亞系的細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2細(xì)胞增殖率測定 用96孔板接種細(xì)胞數(shù)為103/孔,連續(xù)計(jì)數(shù) 7 d,繪制生長曲線。采用Cell Counting Kit-8(CCK8)分析骨肉瘤細(xì)胞增殖。每組取6個(gè)復(fù)孔,將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中,在37℃,5%CO2及95%濕度條件下,培養(yǎng)24 h。每孔加CCK-8試劑10 μ l,放入CO2孵箱中孵育2 h,酶標(biāo)儀波長450 nm,讀取光密度OD值。記錄結(jié)果(細(xì)胞OD值=細(xì)胞孔OD值-清零組OD值)。以不同單克隆亞系為橫坐標(biāo),細(xì)胞增殖百分率(%)為縱坐標(biāo)(以0 h增值率作為100%),使用Microsoft Excel軟件繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3.3軟瓊脂集落形成試驗(yàn) 取37℃保溫的不同密度的細(xì)胞懸液9.4 ml移入小燒杯中,加入50℃5%瓊脂0.6 ml,迅速混勻,立即澆入鋪有底層瓊脂(濃度為0.3%)的24孔培養(yǎng)板中,每孔加0.8 ml,置室溫使瓊脂凝固,每孔細(xì)胞數(shù)為100,接種14 d后,計(jì)算克隆數(shù),每個(gè)集落細(xì)胞數(shù)≥50時(shí)為1個(gè)克隆。

1.3.4細(xì)胞周期檢測 ①取傳代生長良好的對數(shù)生長期細(xì)胞,0.25%胰酶消化收集細(xì)胞。加入4℃預(yù)冷的75%乙醇固定24 h,預(yù)冷PBS洗兩次,1 000 rpm離心5 min,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。加入0.5 ml碘化丙啶(50 μ g/mL),4℃避光染色 30 min。流式細(xì)胞儀分析,在波長為488 nm、300 mv氬離子激光條件下,每份樣品檢測1×104/ml個(gè)細(xì)胞。

1.3.5RT-PCR 將選定細(xì)胞株分別接種24孔板,培養(yǎng)至對數(shù)生長期。胰酶消化制備細(xì)胞懸液,細(xì)胞裂解液加超聲裂解細(xì)胞離心后取上清(各株分 5組)。按試劑盒說明操作。

1.3.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn),P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞單克隆

96孔板中成功分離單細(xì)胞生長的約為60個(gè),其中有23個(gè)克隆成功傳至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)生長,余者皆發(fā)生凋亡或無法繼續(xù)傳代,在同等培養(yǎng)情況下,傳至8-12代又有3個(gè)單克隆細(xì)胞亞系出現(xiàn)自發(fā)性的死亡,而無法繼續(xù)傳代。而分離出各單克隆細(xì)胞亞系的細(xì)胞大體形態(tài)差異顯著。

2.2 細(xì)胞增殖

我們選取大體形態(tài)具有代表性的8個(gè)單克隆細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞生長曲線的測定,其中A3的倍增時(shí)間明顯短于其他單克隆細(xì)胞株,存在明顯差異。選取細(xì)胞都在4-16代之間,每次實(shí)驗(yàn)各克隆選取的細(xì)胞均為同一代次。而其中D1克隆則隨著代次的增加,細(xì)胞增殖速度逐漸加快。圖1為8個(gè)單克隆細(xì)胞株第四代的生長曲線。

圖1 不同分化骨肉瘤細(xì)胞的生長曲線

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)

多數(shù)克隆與克隆前相似,以短梭形和多邊形為主,細(xì)胞排列緊密,胞體大,突起細(xì)長,無接觸抑制,易于堆疊,結(jié)團(tuán),A3形體稍小。另一類呈長梭形(A1,F1)胞體小,胞漿豐富,突起寬而短,有一定接觸抑制,容易形成單細(xì)胞層

2.4 克隆形成率

D1細(xì)胞株形成的克隆數(shù)量最多,而最為顯著的是D1的大克隆形成數(shù)目明顯高于其他細(xì)胞株細(xì)胞。A3的克隆形成能力也明顯高于母系MG63克隆率形成率。其中14天后觀察A3 19.5%;D1 24.2%;大克隆形成率3%,MG63 4.3%.

2.5 成骨分化標(biāo)志物的RT-PCR檢測

A3細(xì)胞株OCN呈低表達(dá),VEGF高表達(dá),stathmin高表達(dá),ALP低表達(dá)。

2.6 細(xì)胞周期分析

A3細(xì)胞株處于DNA合成期(S)的細(xì)胞數(shù)明顯增多,而A1 D1細(xì)胞株的細(xì)胞大多處于GO/G1期,但S期的細(xì)胞數(shù)也明顯多于MG63。

3 討論

細(xì)胞株指的是從一個(gè)經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法得到的同一細(xì)胞起源的細(xì)胞群[3]。在本實(shí)驗(yàn)的單細(xì)胞克隆篩選過程中,我們首先選取了被稱為“Holoclone”的一類的克隆,而所謂的“Holoclone”是從克隆形態(tài)上就是指結(jié)構(gòu)致密呈圓形或者橢圓形的克隆,很多學(xué)者研究表明形成不同克隆的腫瘤細(xì)胞,其具有完全不同的增殖、分化及成瘤能力。而這種情況也在乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤中得到了驗(yàn)證。這充分說明不同的腫瘤克隆形態(tài)根本就是不同的腫瘤分子聚合體的表現(xiàn)形式。而人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞系是Billian切取高加索男孩骨肉瘤組織于體外連續(xù)傳代培養(yǎng)建立的,并經(jīng)過相關(guān)生物學(xué)鑒定。并非單細(xì)胞起源存在異質(zhì)性。我們認(rèn)為其應(yīng)該具有更明顯的腫瘤細(xì)胞間的差異。人成骨肉瘤細(xì)胞系MG63是具有成骨細(xì)胞的表型特征的細(xì)胞系,因此我們推斷異質(zhì)的細(xì)胞系各個(gè)細(xì)胞組分其具有不同的成骨分化程度,而其成骨分化標(biāo)志物的表達(dá)也必然有所不同[4]。

經(jīng)過對一系列的成骨分化標(biāo)志物(如ALP、OCN、OPN、Stathmin)mRNA和蛋白水平上的檢測,發(fā)現(xiàn)由MG63分離而來的多個(gè)單克隆細(xì)胞株確實(shí)在一部分成骨分化標(biāo)志物的表達(dá)量上存在非常顯著的差異,我們認(rèn)為此類成骨分化標(biāo)志物的檢測可以作為判斷臨床骨肉瘤惡性程度的早期診斷標(biāo)準(zhǔn)。

而我們通過對ALP、OCN、OPN 、Stathmin等成骨細(xì)胞標(biāo)志物的檢測和所選取的幾個(gè)代表性細(xì)胞株在大體形態(tài)、周期時(shí)相、集落形成、運(yùn)動能力等方面具有明顯的差異。軟瓊脂集落形成能力是衡量惡性腫瘤成瘤能力的重要指標(biāo)[5],表示細(xì)胞錨著依賴性的喪失;細(xì)胞遷移、侵襲及粘附鋪展實(shí)驗(yàn)是目前檢測細(xì)胞運(yùn)動能力的最為常用也是最為可靠的方法,反映腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)脫離原發(fā)器官的細(xì)胞外基質(zhì)、侵襲而遠(yuǎn)處播散成瘤的能力;其中我們得到的細(xì)胞株D1的成瘤能力明顯高于其他細(xì)胞株及母系MG-63.最后裸鼠體內(nèi)的致瘤實(shí)驗(yàn)最直接地反映了各細(xì)胞株的惡性程度,細(xì)胞株之間存在著的這些細(xì)胞表型差異,對于調(diào)整和明確高侵襲、早轉(zhuǎn)移的高度危險(xiǎn)性骨肉瘤的早期診斷標(biāo)準(zhǔn)的調(diào)整很有意義。

近年來腫瘤干細(xì)胞學(xué)說已經(jīng)對于很多高度惡性的異質(zhì)性腫瘤的病因做出了解釋,有學(xué)者通過懸浮成球?qū)嶒?yàn),克隆形成等一系列實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜃C明確實(shí)在骨肉瘤細(xì)胞中有一個(gè)很小的細(xì)胞亞群具有自我更新能力,而通過本次研究我們推測具有高侵襲和高致瘤能力的細(xì)胞株A3、D1很可能為富集骨肉瘤類干細(xì)胞成分的單克隆細(xì)胞株。

要想對于骨肉瘤進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究,特別是分子水平的研究,細(xì)胞樣本的純度和可比性是關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)使骨肉瘤細(xì)胞由“系”到“株”的目的就是建立一株既成分單一,又具有可比性,且存在分化程度差異的惡性腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位經(jīng)淋巴、血液、體腔等途徑播散到其他部位的過程為腫瘤的遷移,這是其區(qū)別于正常細(xì)胞的生物學(xué)特征之一。而根據(jù)骨肉瘤大體形態(tài)結(jié)合成骨分化標(biāo)志的表達(dá)對骨肉瘤的分化程度進(jìn)行區(qū)分,進(jìn)一步對其惡性程度進(jìn)行早期診斷是確實(shí)而有效的辦法。

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