HPV58型衣殼蛋白L1和L2基因的克隆表達(dá)及病毒樣顆粒的裝配

王麗娜,陳 偉,甘義明,劉艷豐

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科,吉林 長春130021;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院骨科,吉林長春 130031;3.吉林大學(xué)附屬醫(yī)院放射線科,吉林 長春130021)

目前研究已經(jīng)證實(shí)高危型人乳頭瘤病毒的感染是宮頸癌的病因,宮頸癌組織中99%可檢測到HPV。現(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的HPV大約200余型,根據(jù)地域的不同,各型的發(fā)病率也不同。在全世界范圍內(nèi)以16型最常見,在我國和一些亞洲和非洲國家,58型居于第二位[1,2]。鑒于我國58型HPV的高發(fā)的情況,我們開展了HPV58相關(guān)宮頸癌疫苗的基礎(chǔ)研究工作,應(yīng)用真核細(xì)胞大量表達(dá)并純化了HPV衣殼蛋白(L1L2蛋白),組裝成病毒相似顆粒,并對其免疫原性進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 試劑及標(biāo)本的來源

pUC19-HPV58(含全長的 HPV58基因)、由日本國立感染癥研究所神田惠贈。pGEM-T easy質(zhì)粒購自Promega公司。PCR試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶 NotI、KpnI、XhoI購自TAKAR A公司。連接酶、BAP75、HPV16L1抗體購自 Pharmingen公司,羊抗鼠IgG-辣根過氧化物酶、福氏佐劑、pFastBac-1、pFastBac Duel質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染用試劑 Effectene購自QIAGEN公司。引物由日立計(jì)測器服務(wù)株氏會社訂制。DH10Bac菌株、Sf9細(xì)胞及培養(yǎng)液SFII900、兔抗 hpv L2多肽抗體(108-120aa)購自GIBCO Invitrogen corporation公司

1.2 PCR擴(kuò)增58L1,58L2片段克隆測序

以pUC19-HPV58為模板,L1的上游引物 5’-ATGTCCGTGTGGCGGCCTAGT,下游引 物 3’-TTATTTTTTAACCTTTTTGCG。L2的上游引物 5’-CTCGAGATG AGACAAACGGTCTACA,下游引物 3’-GGTACCCTAGGCCGCCACACGGACATC。PCR 反應(yīng)體系:模板 100 ng,ExTaq0.25,引 物各 0.5 mM,dNTP5 μ l,10 ×Buffer 5μ l,加蒸餾水至 50μ l。反應(yīng)條件:94℃ 3min,進(jìn)入循環(huán)94℃30 s,55℃30 s,72℃2 min,循環(huán)25次,72℃延伸7 min。反應(yīng)產(chǎn)物8%瓊脂糖凝膠電泳后回收L1的1574bp片段和L2的1 418 bp片段,過柱純化后,連接入pGEM T easy質(zhì)粒構(gòu)建成pGEM T easy-58L1和pGEM T easy-58L2質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌中擴(kuò)增,提取質(zhì)粒用Genetic Analyzer 310測序儀(ABI PRISM公司)測序。挑取正確的克隆擴(kuò)增DNA進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 構(gòu)建pFast Bac-1-58L1和pFast Bac duel-58L1L2

1.3.1pFast Bac-1-58L1的構(gòu)建 將pFast Bac-1用NotⅠ酶切后,末端去磷酸化。pGEM T easy-58L1NotI酶切后接入pFast Bac-1中構(gòu)建成pFast Bac-1-58L1重組質(zhì)粒。PvuII和HindⅢ雙酶切篩選方向正確插入的重組質(zhì)粒。

1.3.2pFast Bac duel-58L1L2構(gòu)建 pFast Bac duel質(zhì)粒和pGEM T easy-58L2分別用KpnI和XhoⅠ雙酶切后,pFast Bac duel載體側(cè)去磷酸化,插入KpnI-58L2-XhoⅠ片段。酶切篩選正確插入片段的重組質(zhì)粒pFast Bac duel-58L2,此質(zhì)粒用NotI酶切去磷酸化后插入58L1片段,同樣酶切鑒定插入方向。構(gòu)建成pFast Bac duel-58L1L2重組質(zhì)粒。

1.4 重組桿狀病毒載體的構(gòu)建

pFast Bac-1-58L1和 pFast Bac duel-58L1L2分別轉(zhuǎn)導(dǎo)入DH10Bac大腸桿菌中,使其與大腸桿菌中的桿狀病毒DNA(Bacmid)發(fā)生同源重組。PCR鑒定篩選發(fā)生同源重組的桿狀病毒載體Bacmid-58L1,Bacmid-58L1L2。

1.5 昆蟲細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和病毒液的制備

各10 ng的Bacmid-58L1,Bacmid-58L1L2轉(zhuǎn)染 sf9昆蟲細(xì)胞,轉(zhuǎn)染方法按試劑盒所示操作。27C培養(yǎng)三日后回收上清液,即病毒液P1,再以P1感染sf9制備病毒液P2。

1.6 HPV58L1和HPV58L1L2蛋白的大量表達(dá)純化及檢測

用病毒液P2感染sf9細(xì)胞。27℃孵育3日后回收細(xì)胞,3 000 rpm離心5 min。沉淀細(xì)胞PBS緩沖液洗滌2次,加5%NP-40的PBS重旋細(xì)胞后置冰中10 min。4℃,5 000 rpm離心30 min。棄上清,沉淀細(xì)胞核加1.28 g/ml的CsCl-PBS,超聲破碎。31 000 rpm,20℃,離心24 h。96孔板分段收集離心后的液體。各取 1 μ l上樣于10%SDS-PAGE膠,電泳后進(jìn)行考馬斯亮蘭染色和western blot。選取L蛋白濃度最高處的收集液,在PBS緩沖液中透析過夜。5/45%的蔗糖密度梯度離心,35 000 rpm4C,2.5 h。96孔板分段收集。再次SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍(lán)染色,鑒定蛋白是否純化。Westernblot一抗為用小鼠制備的hpv16L1單抗,1∶5 000稀釋。

1.7 電鏡觀察純化后的兩種蛋白是否形成病毒相似顆粒

1.8 制備抗體

取純化的蛋白L1,L1L2。各75 μ g與等體積的佐劑混勻后,生理鹽水稀釋至250 μ l,6周齡的 Balb/C小鼠背部皮下注射,一周后加強(qiáng)免疫一次。五周后再次加強(qiáng)注射一次,加強(qiáng)免疫劑量減半,方法同前。首次免疫后六周處死小鼠,腹主靜脈取血。離心制成抗血清。

1.9 血清中抗體的檢測

取純化的58L1L2蛋白,及純化后的16L1L2共表達(dá)的蛋白(近藤博士贈送)進(jìn)行SDS-PAGE電泳,以上述制備的抗血清(1∶2 000稀釋)為一抗進(jìn)行 Western blot分析,按照 ELC試劑盒操作,STOM顯影。

2 結(jié)果

2.1 HPV58衣殼蛋白與桿狀病毒重組并在昆蟲細(xì)胞中高效表達(dá)

將感染58L1和L1L2重組桿狀病毒的SF9細(xì)胞破壞細(xì)胞核后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍(lán)染色均在55 kD處出現(xiàn)明顯的蛋白條帶,與L1蛋白大小一致。但在70KD處(相當(dāng)于 L2蛋白大小)無明顯條帶出現(xiàn)(結(jié)果未附)。以HPV58L1抗體為一抗的Western-blot結(jié)果顯示兩種重組病毒感染的細(xì)胞均在55KD處出現(xiàn)特異性條帶(圖1A)。而陰性對照組(空載體Bacmid感染的Sf9細(xì)胞)無此蛋白表達(dá)。另外,以HPVL2抗體為一抗的Western-blot結(jié)果顯示 Bacmid-L1L2感染的細(xì)胞在70 kD處出現(xiàn)特異性條帶(圖1B)。

圖1 重組桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞Western-blot分析

2.2 單獨(dú)表達(dá)的58型L1及共表達(dá)的L1L2蛋白均能自主組裝成病毒相似顆粒

兩種純化的蛋白透析后,分別以PBS稀釋后電鏡下觀察病毒顆粒形成情況。單獨(dú)表達(dá)的L1蛋白及L1L2共表達(dá)的蛋白均能形成病毒相似顆粒,大小和形態(tài)與野生型的病毒顆粒難以分辨。如圖2所示。

2.3 用小鼠制備的抗血清中抗體的分析

純化后的HPV58L1-VLP、HPV58L1L2-VLP進(jìn)行SDS-PAGE電泳,用純化后的VLP免疫小鼠所獲得的抗血清HPV58L1 Mb、HPV58L1L2-Mb做一抗進(jìn)行 western-blot分析,結(jié)果如圖3A、3B所示,兩組血清做一抗的電泳均可在55 kD處出現(xiàn)特異性強(qiáng)雜交信號,相當(dāng)于L1蛋白大小。而HPV58L1L2-Mb做一抗的結(jié)果中HPV58L1L2-VLP電泳在70kD處(相當(dāng)于L2蛋白大小)未出現(xiàn)期望的條帶。

圖3 以免疫小鼠制備的抗血清為一抗的Western-blot

3 討論

宮頸癌占女性惡性腫瘤的12%,成為世界范圍的第二位的婦科腫瘤[3]。其中接近80%的病例發(fā)生在發(fā)展中國家。人們已經(jīng)認(rèn)識到HPV感染是宮頸癌的首要病因,因此針對HPV感染的宮頸癌疫苗的研制成為國內(nèi)外學(xué)者研究的焦點(diǎn)。國外學(xué)者研究表明單獨(dú)表達(dá)的 hpv16L1或共表達(dá)的hpv16L1L2自主組裝成的VLP具有與野生病毒相同的抗原表位,以此免疫小鼠,產(chǎn)生的抗體具有中和活性,能抑制HPV的感染。而且這種VLP只是空的蛋白衣殼,不含病毒的原癌基因,不會人為的導(dǎo)致癌變,安全有效,是很有前景的宮頸癌的預(yù)防疫苗。在美國上市的HPV預(yù)防性疫苗是GSK公司開發(fā)的16/18二價疫苗,和Merck公司開發(fā)的6/11/18/16四價疫苗,臨床研究證實(shí)注射后產(chǎn)生的抗體效價比自然感染后產(chǎn)生的抗體效價高50倍。HPV16單價的疫苗對3,4年內(nèi)宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變的發(fā)生起到100%的保護(hù)[4]。采用16/18雙價疫苗對4,5年內(nèi)宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變的發(fā)生起到100%的保護(hù)[5]。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的HPV病毒有200余亞型,與宮頸癌密切相關(guān)的高危型也有18種,迄今還沒有一種疫苗能夠抵抗所有型別的HPV感染。在我國和一些亞洲國家58亞型的感染是僅此于16亞型的,為開發(fā)適合于我國婦女的宮頸癌疫苗,我們對HPV58進(jìn)行了細(xì)致的研究,應(yīng)用桿狀病毒昆蟲表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了hpv58型衣殼蛋白L1單獨(dú)表達(dá)以及L1L2的共表達(dá)。結(jié)果證明了其與hpv16型相同,大量表達(dá)純化的58型hpvL1蛋白能單獨(dú)自主組裝成VLPs。與L2共表達(dá)的L1蛋白亦自主組裝成VLPs。電鏡下其形態(tài)與野生型hpv完全相同。這種hpv58特異的VLPs的制備,對于我國宮頸癌的預(yù)防性疫苗的開發(fā)具有重要的意義。

此實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的目的基因片段-58L1序列是從L1的第二個ATG開始的,去掉了N-末端的26個氨基酸。實(shí)驗(yàn)中曾應(yīng)用完整的L1序列進(jìn)行實(shí)驗(yàn),但表達(dá)的L1蛋白量少,且很難得到純化(結(jié)果未附)。有可能是由于hpv58L1的N末端的幾個氨基酸結(jié)構(gòu)特殊,與細(xì)胞中的其他蛋白結(jié)合,影響L1的純化。實(shí)驗(yàn)表明去除N末端的幾個氨基酸后并不影響所表達(dá)蛋白的活性。仍然具有自主裝配的活性[6]。(L1抗原決定簇被中和抗體識別具有構(gòu)象依賴,變性L1不會誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生,因此保持野生病毒的空間構(gòu)象對預(yù)防性疫苗非常關(guān)鍵,我們純化后的蛋白經(jīng)電鏡檢測證實(shí)L1單獨(dú)以及L1/L2蛋白聯(lián)合均能自主包裝成VLPs,與野生型病毒顆粒外觀一致。

文獻(xiàn)報道野生型病毒中L1與L2的表達(dá)量為30∶1,L2蛋白的表達(dá)量雖然少,但也具備中和表位,研究表明,L2在病毒選擇性包裝乳頭瘤病毒DNA上和增加乳頭瘤病毒的傳染性方面發(fā)揮作用。L2可能還有促進(jìn)病毒顆粒的裝配,抵消E2的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的活性[7]。而且實(shí)驗(yàn)證明在酸性溶液中L1/L2組裝成的VLP比L1單獨(dú)組裝的更穩(wěn)定。關(guān)于5量體的衣殼粒的具體結(jié)合方式尚未解明,但衣殼粒之間相互結(jié)合形成衣殼時,必須有2或3個二硫鍵[8]。

L2的108-120氨基酸是抗原決定簇,針對這個抗原決定簇的抗體具有中和活性。表達(dá)L2-GFP-組氨酸的融合蛋白與多種細(xì)胞共同孵育,隨時間的推移,融合蛋白首先黏附在細(xì)胞膜表面,繼之進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),由此推測L2蛋白可能在病毒感染上發(fā)揮重要作用,因此誘導(dǎo)針對L2的抗體也很重要,我們實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的L2抗體是用兔制備的抗hpv L2多肽抗體(108-120aa),108-120多肽是L2蛋白的中和抗原決定簇所在部位,本次實(shí)驗(yàn)Western-blot結(jié)果顯示L1L2共表達(dá)的產(chǎn)物在70KD處出現(xiàn)淡淡的條帶,說明自主裝配的L1L2VLP可能亦具備L2的中和表位。能增強(qiáng)VLP的免疫反應(yīng)性。我們用所表達(dá)純化的蛋白分別免疫小鼠后均誘導(dǎo)出了高滴度的L1特異性抗體,但與L1共同表達(dá)的L2沒有產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。可能是由于L2的表達(dá)量過少,不足以產(chǎn)生能檢測得到的抗體。今后的目標(biāo)是如何能增強(qiáng)L2蛋白的表達(dá)量,而不影響VLP的形成。制作出能誘導(dǎo)L1,L2中和抗體的疫苗。

[1]Xi LF,Toure P,Critchlow CW,Hawes SE,et al.Prevalence of specific types of human papillomavirus and cervical squamous intraepithelial lesions in consecutive,previously unscreened,West-African women over 35 years of age[J].Int.J.Cancer 2003:103;803.

[2]Chan PK,Li WH,Chan MY,et al.High prevalence of human papillomavirus type 58 in Chinese women with cervical cancer and precancerous lesions[J].J Med Virol,1999,59(2):232.

[3]isani.P,Bray.F,Parkin.DM.Estimates of the worldwide prevalence of cancer for 25 sites in the adult population[J].Int J Cancer,2002,97:72.

[4]Mao C,Koutsky LA,Ault KA,et al.Efficacy of human papillomavirus-16 vaccine to prevent cervical intraep ithelial neop lasia:a randomized controlled trial[J].Obstet Gynecol,2006,107:182.

[5]HarperDM,Franco EL,Wheeler C,et al.Sustained efficacy up to 4.5 years of a bivalent L1virus-like particle vaccine against human papillomavirus types 16 and 18:follow-up from a randomised control trial[J].Lancet,2006,367:1247.

[6]Schiller JT,Lowy DR.Prospects for cervical cancer prevention by human papillomavirus vaccination[J].Cancer Res,2006,66(21):10229.

[7]Heino P,Zhou J,LambertPF.Interaction of the papillomavirus transcription/replication factors,E2,and the viral capsid protein,L2[J].Virology,2000,276:304.

[8]Ishii,Y.et al.Mutational analysis of human papillomavirus type 16 major capsid protein L1:the cysteines affecting the intermolecular bonding and structure of L1-capsids[J].Virology,2003,308:128.