紫杉醇-抗HER2MAb偶聯物體外抗腫瘤活性的研究

張 玲,郭曉雷,張秋影,佟青,曲成剛,施 維,韓智星,張桂榮*

(1.吉林大學第一醫院 檢驗科,吉林 長春130021;2.南航吉林分公司航衛室,吉林 長春130031;3.吉林大學白求恩醫學院生化教研室,吉林長春130021;4.吉林大學分子酶學工程教育部重點實驗室,吉林長春130012)

利用單克隆抗體對腫瘤細胞表面抗原的選擇特 異性,對抗癌藥物進行主動靶向設計研究,可提高抗癌藥物對腫瘤細胞的選擇性,實現靶向治療,降低對正常器官的毒性。1958年,Mathe首次將抗鼠白細胞免疫球蛋白與甲氨蝶偶聯用于靶向治療,隨后出現了各種抗癌藥物與各種抗體的偶聯物。目前,抗體偶聯的靶向抗癌藥物研究正在成為生物技術藥物領域的新熱點,并具有良好的前景。

本課題組采用活化酯法將抗癌化學藥紫杉醇與抗HER2單克隆抗體偶聯,合成了免疫偶聯物(TAX-抗HER2MAb)靶向抗癌藥,本文以乳腺癌MCF-7細胞為藥物作用對象,研究免疫偶聯物TAX-抗HER2MAb的體外抗腫瘤活性,為乳腺癌的靶向治療提供了實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

TAX-抗HER2MAb偶聯物為本課題組先期合成;人乳癌細胞株MCF-7由吉林大學生命科學院酶工程實驗室提供;HER-2抗原Biovision;HRP-羊抗鼠IgG華特生生物技術有限公司;BSA Sigma產品;MTT Genview產品;RPMI-1640美國Hyclone產品;FCS杭州四季青生物工程材料公司;V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒Annexin;DYY-Ⅲ穩壓穩流高壓電泳儀(北京六一儀器廠);Tanon GLS-2010凝膠成像(上海天能);Horaues型二氧化碳培養箱(日本SANYO公司);ELTIE型流式細胞儀(美國Coulter公司);BHZ型光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司);轉膜系統(Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1MTT法檢測T AX-抗HER2MAb偶聯物對腫瘤細胞增殖的抑制作用 實驗設空白對照組(正常培養的MCF-7乳癌細胞懸液)、試劑對照組(加DMSO)、TAX藥物組及偶聯物藥物組(設5個藥物濃度:1.28×10-2nmol/L、6.4×10-2nmol/L、3.2×10-1nmol/L、1.6 nmol/L、8 nmol/L),每組均設3個平行孔。

取對數生長期的乳癌MCF-7細胞,以0.25%胰蛋白酶消化1.5min,1 000 rpm離心5 min,沉淀細胞以RPMI-1640培養液制成5×104個濃度單細胞懸液,接種于 96 孔培養板,每孔 100 μ l,37℃、5%CO2飽和濕度培養24 h后,觀察細胞生長良好,換培養液;按實驗分組向各孔加藥,置37℃、5%CO2飽和濕度培養 20h;每孔加 5 mg/ml的MTT 20 μ l,繼續培養4h終止培養,吸去培養液,每孔加DMSO 150 μ l,振蕩使甲溶解,酶標儀570 nm檢測各孔吸光度值(A值)。按[(1-實驗組平均A值/腫瘤細胞對照組平均A值 )×100%]計算腫瘤細胞的生長抑制率;以藥物濃度的對數為橫坐標,以細胞生長抑制率為縱坐標繪制半對數曲線,計算半數抑制藥物濃度IC50。

1.2.2FCM檢測細胞凋亡率 實驗分組:設陰性對照組(正常培養的MCF-7乳癌細胞)及加藥組(分設為1.6 nmol/L TAX組、1.6 nmol/L偶聯物組及1.6 nmol/L TAX+1.6 nmol/L單抗組)。

對數生長期MCF-7細胞,0.25%的胰蛋白酶消化后,制備5×104/ml單細胞懸液接種于新培養瓶中,37℃,5%CO2培養24 h完全貼壁,把細胞培養液吸出至離心管內,PBS洗滌貼壁細胞,0.25%的胰蛋白酶液消化;加入上步收集的細胞培養液,混勻,轉移至離心管,1 000 rpm離心5min,收集細胞,用PBS輕輕重懸細胞并計數。

細胞凋亡檢測參照Annexin V-FITC試劑盒說明書操作程序操作。

取5-10萬個重懸的細胞,1 000 rpm離心5min,棄上清,加入 195 μ l Annexin V-FITC 結合液輕輕重懸細胞 ;加入 5 μ l Annexin V-FITC,輕輕混勻 ;室溫避光孵育10 min;1 000 rpm離心5 min,棄上清,加入190 μ l Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞;加入10 μ l PI染色液,輕輕混勻,冰浴避光放置;流式細胞儀檢測設空白對照組、PI空白對照組及Annexin VFITC空白對照組分析細胞凋亡情況。

1.2.3瓊脂糖凝膠電泳分析細胞基因組DNA TE飽和酚法分別提取TAX和偶聯物作用24h的腫瘤細胞DNA,瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統分析。

1.2.4Western-blot檢測細胞HER2蛋白表達 以濃度均為1.6 nmol/L的偶聯物及TAX分別加入培養24 h貼壁生長良好的MCF-7細胞繼續培養24 h,離心收集細胞;以細胞裂解液裂解細胞;10 000 rpm 4℃離心3 min,取上清;SDS-PAGE電泳,分離膠濃度15%,積層膠濃度5%,積層膠電壓8 V/cm,分離膠電壓14 V/cm,電泳時間根據溴酚藍指示。考馬斯亮藍染液,脫色。電泳凝膠片按目的蛋白的位置切割并做出標記放入轉移液中;半干式轉移裝置轉PVDF膜,轉膜電流1 mA/cm2,1.5 h;麗春紅染色10 min;室溫去離子水漂洗PVDF膜,直至蛋白條帶消失;5%脫脂奶粉封閉,先后與一抗及HRP-羊抗鼠二抗反應,DAB顯色,攝像保存;β-Tubulin作內參。

1.2.5統計學分析 MTT結果以均數±標準差表示,兩兩均數之間的比較使用 t檢驗;以P＜0.05為具有統計學意義。數據分析采用SPSS11.5軟件進行統計學處理。

2 結果

2.1 MTT法檢測TAX-抗HER2MAb偶聯物對腫瘤細胞增殖的抑制作用

對細胞的抑制作用TAX實驗組與TAX-抗HER2MAb偶聯物實驗組在相同藥物濃度時,偶聯物組抑制率明顯高于TAX組,經統計學處理具有統計學意義(P＜0.05),見表2.1和圖2.1。半數抑制率藥物濃度(IC50)TAX組為6.00 nmol/L,偶聯物組為3.97 nmol/L,二者相比較具有統計學意義(P＜0.05)。

圖2.1 TAX-抗HER2MAb偶聯物與TAX對MCF-7細胞的生長抑制率

表2.1 各組吸光度值與細胞生長抑制率(s)

表2.1 各組吸光度值與細胞生長抑制率(s)

*P＜0.05

分組 吸光度 抑制率DMSO溶劑對照組 0.1766±0.0023腫瘤細胞對照組 0.6656±0.0050紫杉醇組nmol/L 1.28×10-2 0.552 6±0.0047 0.198 2±0.012 5 6.4×10-2 0.531 0±0.0052 0.258 9±0.011 2 3.2×10-1 0.498 0±0.0010 0.335 1±0.009 0 1.28×10-2 0.492 3±0.004 00.327 0±0.007 8*6.4×10-2 0.469 3±0.001 50.385 6±0.006 0*3.2×10-1 0.450 3±0.003 70.433 7±0.012 0*

2.2 FCM檢測細胞凋亡率

經流式細胞儀檢測,腫瘤細胞對照組即陰性對照組中細胞凋亡率為1.5%,TAX組細胞凋亡率為12.5%,TAX+抗HER2單抗組細胞凋亡率為13.9%,而偶聯物組細胞凋亡率為25.9%,圖2.2。

圖2.2 Annexin V/PI雙染色法檢測MCF-7細胞凋亡率圖譜

2.3 瓊脂糖凝膠電泳分析凋亡細胞DNA

由圖2.3可以看出,經TAX和偶聯物處理的MCF-7乳腺癌細胞均出現了細胞凋亡DNA特征性梯狀條帶,偶聯物組較TAX組凋亡數多;對照組細胞基因組DNA比較完整。表明藥物對腫瘤細胞有促進凋亡作用,并且偶聯物組促凋亡效果明顯。

圖2.3 腫瘤細胞凋亡DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.4 Western-blot檢測細胞HER2蛋白表達水平

轉膜后內參蛋白和HER2蛋白的免疫印跡圖譜如圖2.4。由圖可見HER2蛋白表達量偶聯物藥物組低于TAX組,TAX組低于對照組。

3 討論

隨著對惡性腫瘤發生和發展分子機制的深入研究,分子靶向治療在腫瘤的治療領域越來越受到重視。靶向藥物最顯著特點是能將藥物最大限度地運送到靶區,使藥物在靶區濃集,直接作用于病變組織、器官和細胞,延長藥物與靶部位的作用時間,從而減少用藥量和藥物的毒副作用[1]。根據藥物分子的大小,可將分子靶向抗腫瘤藥物分為大分子單克隆抗體類和小分子化合物類[2]。

圖2.4 Western-blot圖譜

單克隆抗體靶向藥物是利用單抗對腫瘤表面相關抗原特異性識別,把藥物直接導向腫瘤細胞,提高藥物的療效,降低藥物對循環系統及其他部位的毒性。目前抗腫瘤單克隆抗體可以分為兩類:①單克隆抗體:單克隆抗體作為藥物能特異結合到腫瘤細胞表面,通過直接的抗原-抗體反應導致細胞調亡。1997年以來,美國FDA已先后批準9種抗體藥物用于腫瘤治療。②抗腫瘤單克隆抗體偶聯物,又稱免疫偶聯物(immunoconjugate),即單克隆抗體與抗癌化學藥、毒素等的偶聯復合體。

紫杉醇(paclitaxel)系FDA于1992年12月批準上市的抗癌藥,由于其抗癌譜廣、副作用相應小于其他抗腫瘤藥物,已成為臨床上廣泛使用的首選抗癌藥物。紫杉醇抗癌作用機制比較復雜,現在普遍認同的機制有:①微管穩定作用;②免疫機制;③誘導細胞凋亡;④抑制腫瘤細胞遷移[3,4]。

HER2是跨膜受體,其胞外域信號分子結合部位與配體結合后被活化而引發相關信號分子級聯激活,進而傳遞到胞內靶分子而激活靶基因。HER2的基因過表達見于25%-30%的乳癌患者,也是乳癌發展進程中最有用的分子預后指標[5]。已經證實HER2基因的致癌性是通過該基因的過表達。

HER2單克隆抗體能夠特異識別和結合HER2,進而干擾由HER2介導的細胞信號轉導途徑,抑制有絲分裂、細胞周期、侵襲和轉移、血管形成及DNA修復;另外HER2單克隆抗體具有增強乳癌細胞對化療的敏感性的作用[6,7,8]。

通過MTT法體外腫瘤細胞增殖的抑制作用表明TAX-抗HER2MAb偶聯物的作用高于單純的TAX,半數抑制率時藥物的濃度(IC50)TAX組為6.00 nmol/L,偶聯物組為3.97 nmol/L,即在達到相同抗腫瘤作用時用藥量可以減少20.3%。Western-blot檢測HER2蛋白表達,偶聯物可以明顯抑制腫瘤細胞HER2蛋白的表達量,闡明偶聯物可能阻斷了由HER2介導的細胞信號轉導途徑,使HER2基因的表達下調。FCM法細胞凋亡檢測及凋亡細胞基因組DNA檢測研究表明,偶聯物對腫瘤細胞的抑制、誘導凋亡等作用比紫杉醇及紫杉醇+HER2單克隆抗體效果好,具有統計學意義。本文通過體外抗腫瘤實驗研究,初步證明TAX-抗HER2MAb偶聯物的抗腫瘤作用強于單純的 TAX、HER2單抗及 TAX+HER2單抗,為靶向藥物的合成及臨床應用奠定了實驗基礎。

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