Syk基因轉染對人結腸癌細胞系影響的實驗研究

于慶功,常慧麗,李明強,舒 敏,王 偉,劉春英

(大連大學附屬中山醫院消化科,遼寧大連116001)

Syk(Spleen tyrosine kinase)是一種B細胞激活信號轉導中最重要的激酶[1]。近來對Syk與腫瘤相關性研究證實,Syk可以抑制多種惡性腫瘤的生長,從而引發了對非受體酪氨酸激酶在腫瘤發生發展和轉移過程中作用的研究。腫瘤的發生發展轉移是多階段、多因素的復雜過程,其中逃避免疫監視則是最為重要的環節之一[2]。因此,分析與Syk基因有關的抗腫瘤免疫活性,探討因Syk表達缺失而導致的腫瘤免疫逃逸作用及其機制具有十分重要的價值。本研究將Syk基因克隆到逆轉錄病毒載體中,在脂質體作用下將該載體轉染人結腸腺癌細胞LoVo,檢測該細胞的生長周期變化。

1 材料與方法

1.1 材料

人結腸腺癌細胞系LoVo購自中國科學院上海細胞庫。DH5α,逆轉錄病毒載體 pLNCX為本室保存。PCR試劑盒、反轉錄PCR擴增試劑盒、DNA連接試劑盒和限制性內切酶購自寶生物大連有限公司 。TRIzolTM Reagent、Lipofectamin、Genecitin 購自GIBCO BRL公司。

1.2 方法

1.2.1目的基因的聚合酶鏈反應(PCR)按TR I-zol試劑盒說明書提取脾臟組織總RNA,根據反轉錄和PCR試劑盒操作說明擴增Syk cDNA。根據Gen-Bank中登錄的Syk cDNA序列設計引物,上游引物序列為:5′2CACC ATG GCC AGC AGC GGC ATGGCT G23′,下游引物序列為 :5′2GTT CAC CAC GTC ATA GTAGTA ATT GCG23′。hGAPDH PCR 引物:5′-TCC TCT GAC TTC AAC AGC GAC ACC-3′和 5′-TCT CTC TTC CTC TTG TGC TCT TGG-3′。擴增產物用 5 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.2Syk基因逆轉錄病毒表達載體的構建 收集脾臟組織細胞,一步法提取細胞總RNA,經逆轉錄合成cDNA,以特異引物進行PCR擴增,其擴增長度為1909bp。循環參數為:預變性94℃1分鐘,變性98℃10秒;退火55℃30秒;延伸72℃1分鐘,循環30次,后延伸72℃5分鐘。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳,回收。回收的PCR產物和逆轉錄病毒載體分別用Cla I和Hind III雙酶切,在T4DNA連接酶作用下進行目的基因cDNA片段克隆,構建成Syk基因的真核表達載體,命名為pLNCX-Syk。質粒pLNCXSyk轉化到DH5?感受態菌,通過PCR、酶切鑒定重組,采用ABI PRISMTM 377(Perkin Elmer)型全自動測序儀進行測序。

1.2.3pLNCX-Syk轉染LoVo細胞 pLNCX-Syk質粒經Lipofectamine介導轉染結腸癌細胞。轉染后36小時,加入 Genecitin(200 μ g/ml)篩選細胞。篩選7天,挑出耐受新霉素而能生長的陽性克隆命名為pLNCX-Syk+,此時空白對照細胞全部死亡。Genecitin終濃度改用100 μ g/ml擴增培養陽性克隆5周后,用于以下實驗。空質粒載體pLNCX轉染結腸癌細胞的陽性克隆命名為pLNCX-Syk-,作為陰性對照。

1.2.4Southern blot分析 為了檢測外源基因是否整合于結腸癌細胞基因組之中,選擇逆轉錄病毒載體上的抗性基因——新霉素(Neo)基因編碼區片段作為探針進行雜交,探針大小為770 bp。選擇Neo基因編碼區兩側的EcoR I和BamH I酶切位點,對基因組DNA進行酶切。提取細胞基因組DNA轉移至尼龍膜上,以Neo為探針進行雜交。

1.2.5轉染細胞中Syk基因轉錄的檢測 逆轉錄病毒載體引物經計算機網上檢索確認與人類細胞基因組無同源性,所以細胞基因組中如果沒有外源載體引物基因,RT-PCR結果將為陰性。如有載體引物基因mRNA轉錄,RT-PCR將為陽性結果。使用載體引物,RT-PCR鑒定Syk基因mRNA在細胞內的轉錄。逆轉錄反應體系中以DEPC水代替AMV作為陰性對照。PCR反應產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳,回收片段并純化,以載體引物為測序引物,對上述片段進行測序。

1.2.6細胞生長倍增時間的測定 接種細胞(1×104/孔)于24孔板中,每隔24h對每種細胞的3個孔進行消化計數,求平均值。細胞倍增時間計算方法:培養96小時后計數的細胞數=接種的細胞數×2n(n=細胞96小時的增殖倍數),細胞倍增時間(小時)=96/n

2 結果

2.1 重組質粒pLNCX-Syk的鑒定

重組質粒DNA用限制性內切酶Cla I和HindⅢ雙酶切,1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示的條帶與設計大小一致[圖1]。應用pLNCX載體引物進行目的基因測序,測序結果與Gene Bank(AF015950)完全一致,沒有發生堿基突變。

2.2 Southern雜交鑒定

用EcoRⅠ和BamH Ⅰ雙酶切,可切下包含Neo基因編碼區的DNA片段。因此,以Neo基因編碼區片段作為探針進行雜交,可以檢測到分子量在1 900 bp左右的雜交帶[圖2]。結果顯示,轉染逆轉錄病毒載體pLNCX和pLNCX-Syk質粒的LoVo細胞均有雜交帶,而未轉染的細胞沒有雜交帶。說明外源Syk基因已整合到LoVo細胞基因組。

2.3 轉染細胞中Syk基因mRNA水平的檢測

提取轉染細胞的總 RNA,應用載體引物進行RT-PCR檢測,結果表明Syk基因在mRNA水平有轉錄,而陰性對照則沒有轉錄[圖3]。同時將RT-PCR反應產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳,回收片段并純化,以pLNCX載體引物為測序引物進行測序,結果與設計序列完全一致,再次證明外源Syk基因在細胞內能夠轉錄。

2.4 細胞生長分析

pLNCX-Syk+細胞較pLNCX-Syk-細胞生長明顯緩慢,pLNCX-Syk-細胞的倍增時間為30-33小時,而pLNCX-Syk+細胞倍增時間延長至68-72 h,說明對結腸癌細胞的生長有明顯的抑制作用。

圖1 重組質粒酶切鑒定

圖2 Southern雜交鑒定

圖3 轉染細胞中Syk基因mRNA水平的檢測

3 討論

人類Syk編碼基因為Syk基因,位于人類染色體9q22,蛋白質分子量為72 KD,由629個氨基酸組成,是一種非受體型的酪氨酸激酶,在B細胞的成熟和活化過程中起關鍵性作用[3]。Syk在自體磷酸化部位含有兩個Src同源功能區SH2(N)和SH2(C),與T細胞激活中的ZAP-70屬于同一個蛋白酪氨酸激酶(PTKs)家族,是磷酸化ITAM(依賴酪氨酸的免疫受體活化基序)招募的首選對象,與之結合后而激活,進而啟動B細胞活化信號轉導途徑,激活各種轉錄因子轉位進入細胞核,使相應基因產物表達,調整B細胞等細胞克隆的蛋白質表達、細胞分化或凋亡[4]。Syk基因的表達缺失會致T、B淋巴細胞活化障礙,失去了對異化細胞的監測作用,從而導致腫瘤的形成和轉移[5,6]。研究發現,Syk不但是免疫調節因子,在腫瘤發生發展中也發揮著重要的作用。目前研究發現在多種惡性腫瘤的發病過程中存在著Syk表達缺失的現象。Coopman等發現Syk是促進乳腺上皮細胞生長的強力因子,他們通過正常乳腺組織和乳腺癌的原位雜交實驗驗證了Syk在正常乳腺上皮細胞和正常乳腺上皮細胞株MCF10A中表達,在原位癌中表達受抑制,而在有典型惡性表現(高轉移性和侵襲性)的乳腺癌中表達缺失,進而提出Syk表達缺失與腫瘤的發生存在相關性[7]。Sada等認為Syk是一種候選抑癌基因,Syk的表達缺失會致免疫細胞發育、成熟障礙,重者會導致重癥聯合免疫缺陷病(SCID),由于機體免疫細胞的成熟障礙,機體的免疫監測力下降,對突變、異常增生的細胞失去免疫力,從而導致腫瘤易發[8,9]。

大腸癌惡性生物學特性的表達是依賴于多因素影響和多基因調控的,抑癌基因在大腸癌發生發展過程中的作用日益受到重視。楊祖立等采用巢式雙重甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSP)和RT-PCR方法檢測120結直腸癌病例探討Syk基因啟動子甲基化與結直腸癌侵襲轉移之間的關系發現120例結直腸癌患者中,48例未檢測到Syk mRNA的表達,而癌旁正常組織均有表達;37例腫瘤組織發生Syk基因啟動子甲基化,癌組織Syk基因啟動子甲基化顯著高于正常組織;有淋巴結轉移的56例中,24例發生Syk基因啟動子甲基化,而無淋巴結轉移的64例中,13例發生甲基化,有淋巴結轉移的Syk基因啟動子甲基化發生率顯著高于無淋巴結轉移組,而發生甲基化的腫瘤組織中均無SykmRNA的表達,說明基因甲基化可以導致Sykm-RNA的表達缺失,進而引起結直腸癌的侵襲性增強,這可能是結直腸癌發生侵襲、轉移的又一種機制[10]。本實驗結果顯示,轉染Syk cDNA的LoVo細胞比轉染空載體和未轉染的細胞倍增時間顯著延長,提示Syk基因逆轉錄病毒載體通過外源Syk基因mRNA水平的表達,從而抑制人結腸腺癌細胞的生長。

Syk在大腸癌中的作用機制、表達缺失的原因以及Syk如何抑制腫瘤細胞侵襲生長與轉移的具體機制等尚不清楚。有研究認為HER 2的過度表達可以使內皮細胞收縮,內皮細胞間隙增寬,使腫瘤細胞易于從內皮細胞穿越,從而易于使腫瘤細胞發生轉移。Syk與HER 2的作用相反,其抑制癌的轉移可能是通過拮抗HER2的作用,擴張內皮細胞,減少內皮細胞間隙來實現。綜合上述研究表明Syk對大腸癌的生長和轉移可能有抑制作用,進一步研究Syk基因的作用機制,可為大腸癌的治療提供新的思路。

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[10]楊祖立,汪建平,元云飛,等.結直腸侵襲性與脾酪氨酸激酶基因Syk啟動子甲基化的關系[J].中華實驗外科雜志,2005,22(1):68.