預防性MPT64和ESAT6疫苗保護力的評價

王金河,孫海林,李洪敏,吳雪瓊,梁建琴,馮士生,孫 靜

(1.解放軍第309醫院結研所結核二科,北京100091;2.鄂爾多斯二院結核科;3.朝陽區疾病預防控制中心,吉林長春130021)

當前,結核病在世界范圍內疫情回升,迄今仍然是危害人類健康的主要傳染病。結核病已成為傳染病中的第一號殺手和最大的死亡病因之一。為探索結核病控制的新途徑,利用BACTEC MGIT 960儀器分析動物實驗模型主要臟器的結核分枝桿菌(MT)生長情況,觀察MT的MPT64、ESAT6質粒DNA疫苗預防結核病的效力。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 BALB/C小鼠由北京藥檢所動物中心提供。

1.1.2MT強毒株(H37RV)由中國藥品生物制品鑒定所提供。

1.1.3質粒 JW4303-MPT64和JW4303-ESAT 6重組表達質粒、宿主菌大腸桿菌DH5a由本院研究室提供,卡介苗由成都生物制品研究所提供。

1.2BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養儀及其相關試劑由美國BD提供。

1.3方法

1.3.1實驗分組 6～8周齡雌性的 BALB/C小鼠38只,購于北京藥檢所動物中心,分為五組。A組6只,雙側脛前肌各注射生理鹽水0.1 ml;B組6只,緩慢注射50 μ g/50 μ l載體質粒;C 組6只,注射卡介苗 0.1 ml;D 組 10 只 ,緩慢注射 50 μ g/50 μ l重組質粒JW4303-MPT64 DNA;E組10只,注射重組質粒JW4303-ESAT6 DNA(方法同D組)除C組外,其他四組分別于0、3、6周各免疫3次。

1.3.2H37RV MT強毒株(5X106 CFU/ML)攻擊小鼠。在9周時每只注射0.5 ml于小鼠腹腔內。攻擊一個月后,將每組前3只小鼠殺死。用75%乙醇浸泡小鼠20分鐘,開腹取出肺、肝、脾。用無菌生理鹽水沖洗,然后放入組織研磨器內研磨。取研磨好的組織懸液0.1 ml加入到0.9 ml生理鹽水中混勻,取0.5 ml接種于BACTEC MGIT 7H9培養管中,加入0.8 ml添加劑,放入BACTEC MGIT 960培養儀內進行培養。各組剩余的小鼠被攻擊兩個月后,將其全部殺死,重復上述操作步驟,用BACTEC MGIT 960培養儀進行培養。每日觀察培養結果,若為陰性結果需培養42天。

1.3.3淋巴細胞轉化試驗 取小鼠脾研磨好的組織懸液,加入淋巴細胞分離液,離心后,吸取淋巴細胞層,與適度PHA混合,置37℃培養72小時。取培養的淋巴細胞進行涂片、染色、鏡檢。根據細胞大小、核與胞質的比例、胞質的染色性質和核結構以及有無核仁等情況,分別計數轉化細胞(包栝大淋巴細胞、過渡型母細胞、核絲分裂相細胞)和小淋巴細胞,以百分率報之。

1.3.4統計學方法 在進行淋巴細胞轉化試驗時,采用對比試驗的統計試驗方法。采用的統計量為

其中n1.表示A組的觀察細胞數。n11表示轉化的細胞數,n12表示未轉化的細胞數。n2.表示C組的細胞觀察數。n21表示細胞轉化數,n22表示未轉化數.K的分布近似地遵從分布。

2 結果

MT H37RV強毒株攻擊一個月的小鼠肺、脾、肝培養結果,樣本最快檢出時間為6天,90%陽性樣本檢出時間為7-13天,最遲檢出時間為40天,41-42天均無陽性樣本檢出。小鼠肺、脾、肝用BACTEC—960培養的每天GI(生長指數)平均值分別見圖1。A、B、C、D、E組的淋巴細胞轉化率(%)平均值分別為 54.2%;52.7%;53.8%;60.5%;56.3%。其中D、E組轉化率明顯高于B組。攻擊二個月的小鼠肺、脾、肝的培養結果,樣本最快檢出時間為5天,90%陽性樣本檢出時間為10-15天,最遲檢出時間為30天,31-42天均無陽性樣本檢出。小鼠肺、脾、肝用BACTEC 960培養的每天GI平均值分別見圖2。A、B、C、D、E組的淋巴細胞轉化率(%)平均值分別為46%;46.6%;54%;63%;59.83%。其中C、D、E組明顯高于B。

一、二個月生長指數(GI)值的比較(見圖3)其中,肺和肝數值明顯降低,差異顯箸(P＜0.05)。小鼠脾的數值無明顯變化。

在淋巴細胞轉化率(%)試驗中,第二個月的淋巴細胞轉化率平均值明顯高于第一個月(見表1),以D組為最高。

圖1 一個月MT生長指數

圖2 二個月MT生長指數

圖3 MT攻擊小鼠一,二月肺的比較

表1 各組淋巴細胞轉化試驗對比

3 討論

國際研究已證明了結核病的DNA免疫可表達和傳遞蛋白抗原,誘導機體產生細胞和體液免疫應答,對分枝桿菌產生保護性免疫[2、3、4],而國內尚無報導。為探索結核病控制的新途徑,利用BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養儀進行動物實驗模型分析[1],以觀察MT的MPT64、ESAT6質粒DNA疫苗的保護效力。

分枝桿菌的抗原既有共同抗原又有種的特異性抗原,其抗原總數多達100種以上。保護性抗原是種特異性抗原的決定簇,還是共同抗原的決定簇,或者二者兼備尚在研究中。在MT的免疫應答中,哪一種抗原占主導地位、起主要作用就必須借助動物試驗進行細致的研究。DNA疫苗的作用原理是使外源基因在真核細胞內表達,表達的蛋白抗原和MHCⅠ類分子結合后,被送到細胞表面,再被CD8+T淋巴細胞的受體識別而誘發CTL的細胞毒反應,這對細胞內寄生的分枝桿菌有很大的殺傷作用。MPT64、ESAT6質粒DNA都是分枝桿菌復合群主要的分泌性蛋白質,也是其重要的T細胞抗原。本研究將上述二種DNA疫苗免疫小鼠,借以觀察小鼠的體液免疫和細胞免疫應答,并通過試驗評價這二種DNA疫苗的保護作用。

利用BACTEC 960全自動分枝桿菌培養儀進行動物試驗模型主要臟器的MT生長情況,研究資料顯示上述二種DNA疫苗在小動物試驗的預防過程中是有效力的(見表1)。DNA組細菌計數下降率比載體對照組(B)明顯。第二個月比第一個月培養時間明顯向后推遲且集中。同時,第二個月曲峰強度也比第一個月明顯減弱,可能說明小鼠經DNA疫苗刺激后,免疫力增強,使MT生長受抑制和生長速度減慢的原故。據Kamath報道[2]用呼吸道氣霧攻擊小鼠4周時,MPT64DNA疫苗可使肺部MT菌落數比載體對照減少0.38log10,與本試驗相同,但試驗中也反應出小鼠個體生長指數差異明顯,從各組間分析,除A組之外,其它各組小鼠肺和肝GI值均有不同程度的下降,以D組最明顯,淋巴細胞轉化率也證明了這一點。說明D組的重組質粒JW4303-MPT64保護力優于E組ESAT6質粒DNA疫苗的保護效力。C組卡介苗第一個月預防效力比第二個月強,證明卡介苗保護效力好,但隨時間的延長,此作用開始減弱。小鼠脾的計數無規律,可能與之對MT不敏感有關?？傊?與B組比,小鼠免疫力的短期預防是有所增強,其中卡介苗前期效果明顯;MPT64、ESAT6是持續效果好。

[1]Black GF,Weir RE,Floyd S,et al.BCG-induced increase in interferongamma response to mycobacterial antigens and efficacy of BCG vaccination in Malawi and the UK:two randomised controlled studies[J].Lancet,2002,35:1393.

[2]Brandt L,Feino Cunha J,Weinreich Olsen A,et al.Failure of the Mycobacterium bovis BCG vaccine:some species of environmental mycobacteria block multiplication of BCG and induction of protective immunity to tuberculosis[J].Infect Immun,2002,70:672.

[3]Cole ST,Brosch R,Parkhill J,et al.Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence[J].Nature,1998,39:537.

[4]Glickman MS,Jacobs WR Jr.Microbial pathogenesis of Myco bacterium tuberculosis:dawn of a discipline[J].Cell,2001,104:477.

[5]Kamath AT,Feng CG,Macdonald M,et al.Differential protective efficacy of DNA Vaccines expressing secreted proteins of Mycobacterium teberculosis[J].Infect Immun,1999,67:1702.

[6]Pym AS,Brodin P,Brosch R,et al.Loss of RD1 contributed to the attenuation of the live tuberculosis vaccinesMycobacterium bovis BCG and Mycobacterium microti[J].Mol Microbiol,2002,46:709.