小鼠腹腔異位心臟移植模型的建立及移植心功能監(jiān)測

王遠(yuǎn)濤,胡 鈺,王 鋼,高寶山,欒秀華,曹彥明,王金國*

(1.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院泌尿系統(tǒng)疾病診治中心,吉林長春130021;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院病理科)

目前國內(nèi)外對于大鼠心臟移植模型的制作已較為成熟,而小鼠與大鼠相比具有更多優(yōu)點(diǎn),如遺傳背景清晰,成本低廉等,其腹部心臟移植模型正被越來越被廣泛的應(yīng)用于器官移植免疫的研究[1]。但由于小鼠個體小、血管細(xì)、手術(shù)耐受性差,手術(shù)難度高于大鼠。本實(shí)驗(yàn)借鑒國內(nèi)外報道的手術(shù)方式,并加以改良,成功的建立了小鼠腹部異位心臟移植模型,提高了手術(shù)成功率,降低了操作難度。并可通過腹部移植心觸診,監(jiān)測移植心功能,操作簡便準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組 選取雌性C57BL/6小鼠180只,BALB/C小鼠60只,約6-8周齡,體重15-20 g,購于吉林大學(xué)第一醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心。同系同基因組:C57BL/6小鼠120只,分別作為供、受體;同系異基因組:BALB/C小鼠 60只作為供體,C57BL/C小鼠60只作受體。供、受體體重差異無顯著性,手術(shù)前后不禁飲食。

1.1.2手術(shù)器械及試劑 單人雙目手術(shù)顯微鏡一臺購于深圳瑞沃德公司;顯微手術(shù)器械購于德國Roboz公司;10-0帶線縫合針購于美國Ethicon;5-0及6-0醫(yī)用絲線上海醫(yī)用縫合廠;水合氯醛及肝素由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 手術(shù)方法

1.2.1供體手術(shù) 麻醉采用腹腔注射4%水合氯醛(10 μ l/g)的方法。供體小鼠麻醉滿意后,四肢用膠帶固定于自制鼠板上。腹部剃毛后、酒精消毒后迅速沿正中切口進(jìn)入腹腔,顯露下腔靜脈,經(jīng)下腔靜脈靜推注1%的肝素鹽水0.3 mL,使供體小鼠全身肝素化。約1 min后,剪斷腹主動脈放血,并迅速剪開膈肌,沿胸骨中線剪開胸骨至頸部,自制胸腔拉鉤牽拉兩側(cè)肋骨,剝離胸腺組織,充分暴露心臟并迅速噴灑冰鹽水降溫。迅速結(jié)扎下腔靜脈,于右肺門靠近心臟處6-0絲線集束結(jié)扎,剪除右肺。充分游離肺動脈至分叉處橫斷;充分游離主動脈,并于主動脈弓頭臂干分支遠(yuǎn)側(cè)30G細(xì)針穿刺,以10 ml冰鹽水灌洗心臟至顏色蒼白為止,并于頭臂干分支近側(cè)將其橫斷。其余血管及組織于近心臟側(cè)集束結(jié)扎并切斷。取下供心,置于4℃生理鹽水中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2受體手術(shù) 將小鼠用上法麻醉滿意后,固定于鼠板上。腹部剃毛、消毒后,經(jīng)正中切口單層進(jìn)腹;切口上至劍突,下至恥骨上膀胱區(qū)。腹壁切口兩側(cè)采用自制拉鉤牽拉固定。剪開小腸與直腸間的系膜,將腸管向右上腹推移,充分顯露下腔靜脈及腹主動脈,上至腎動靜脈水平,下至髂血管水平,并以濕鹽水紗布包裹,保護(hù)腸管。用棉簽充分游離下腔靜脈及腹主動脈周圍結(jié)締組織,電灼器燒斷細(xì)小血管分支,清除腹腔及髂血管處淋巴結(jié)。血管夾同時阻斷下腔靜脈及腹主動脈,用30G針頭于腹主動脈戳一小孔,然后沿孔作一縱行切口,行供心主動脈和受體腹主動脈端側(cè)吻合。吻合方法為:將供心以冰鹽水紗布覆蓋并置于小鼠右側(cè)腹腔,10-0血管吻合線于吻合口兩端各作一牽引線,自頭側(cè)一針連續(xù)縫合至尾側(cè)打結(jié)固定后,翻轉(zhuǎn)心臟至左側(cè),行后壁連續(xù)縫合,與頭側(cè)牽引線打結(jié)固定。同法剪開下腔靜脈,行肺動脈和下腔靜脈端側(cè)吻合,吻合方法為:將供心翻于腹腔左側(cè),于吻合口兩端各作一牽引線,自尾側(cè)一針連續(xù)縫合至頭側(cè)打結(jié)固定后,翻轉(zhuǎn)心臟至右側(cè),頭側(cè)牽引線穿過供心主動脈與肺動脈間隙后,連續(xù)縫合至尾側(cè)打結(jié)固定。吻合完畢后,緩慢打開血管夾,同時檢查吻合口有無滲血,棉簽壓迫靜脈吻合口處10秒,待右心室充盈后松開棉簽。棉簽輕觸心臟,促其復(fù)跳。觀察移植心復(fù)跳有力后,將腸管復(fù)位后,單層連續(xù)縫合關(guān)閉腹腔。燈下保溫至小鼠蘇醒。術(shù)后不限食水。

1.2.3移植心功能監(jiān)測 為避免出血,術(shù)后3天內(nèi)不行腹部移植心觸診;3天后開始每天行腹部移植心觸診,心功能根據(jù)移植心跳動由強(qiáng)到弱分為4-0級,每天記錄。以指尖不能觸及移植心跳動記為0級,并作為移植心排斥的時間點(diǎn)。所有0級心臟移植物均需剖腹探查證實(shí)移植心停跳,并取下移植心行病理學(xué)檢查。以術(shù)后100天作為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn),所有心臟移植物均行病理學(xué)檢查。

2 結(jié)果

共行手術(shù)120例,手術(shù)成功110例并長期存活,4例術(shù)中出現(xiàn)吻合口出血,2例術(shù)后移植心內(nèi)出現(xiàn)血栓,2例術(shù)后復(fù)跳不佳,1例出現(xiàn)動脈血栓至下肢癱瘓,1例出現(xiàn)麻醉意外,手術(shù)成功率91.67%(110/120)。供體手術(shù)時間(13.4±1.1)min,受體手術(shù)時間(40.2±2.8)min,其中吻合時間(25.6±2.5)min。

同系同基因組:手術(shù)成功56例,術(shù)后100天內(nèi)經(jīng)腹部移植心觸診,移植心跳規(guī)律,搏動有力,心功能分級均保持在4-3級,MST＞100天;同系異基因組:手術(shù)成功54例,通過移植心觸診,多數(shù)移植心從術(shù)后5天開始出現(xiàn)不同程度的心律減慢、心律不齊、搏動減弱,移植心體積變大等表現(xiàn),心功能等級由4級開始明顯降低;絕大多數(shù)移植心功能分級于術(shù)后7天降至0級,表現(xiàn)為移植心觸診不能觸及任何搏動,移植心體積明顯增大,質(zhì)地硬,移植心MST=7天。

心臟移植物行H&E染色,觀察移植心內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤情況。同系異基因組心臟移植物內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤,且毛細(xì)血管內(nèi)膜顯著增厚,管腔堵塞(圖1 A);同系同基因組移植心內(nèi),未見明確炎性細(xì)胞浸潤,毛細(xì)血管內(nèi)膜正常,管腔通常(圖1 B)。

圖1 移植心H&E染色結(jié)果

3 討論

以往心臟移植模型中較多應(yīng)用的是小鼠頸部心臟移植[2,3],由于頸部空間相對較小,操作難度大,且需使用套管,對血流影響大,移植心觸診范圍小,這些都可以對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。因此,目前國外大多推薦采用腹部異位移植模型[4-5]。現(xiàn)將筆者等執(zhí)行本實(shí)驗(yàn)的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)討論如下。

3.1 供心切取

整個過程最好要控制在15 min之內(nèi),這樣有利于供心質(zhì)量的控制。需仔細(xì)分離升主動脈與肺動脈之間的韌帶,以免吻合時相互牽拉,影響手術(shù)進(jìn)度。應(yīng)盡可能保留較長的主動脈及肺動脈,以便吻合。集束結(jié)扎右肺門時,應(yīng)注保護(hù)右心耳根部竇房結(jié),以免影響心臟復(fù)跳。集束結(jié)心臟背側(cè)血管時,切忌損傷左右心耳,否則也易造成術(shù)后出血不止。供心切取過程中,需主動脈弓穿刺冰鹽水灌洗,可更好的保護(hù)心肌功能,防止血栓形成。

3.2 受體手術(shù)

由于腹主動脈和下腔靜脈緊密相連,因此不必強(qiáng)求分開,但血管周圍脂肪及大的淋巴結(jié)必須剔除干凈,以免影響吻合。受體的腰部分支血管需用電灼器燒斷,以免分離過程中撕破血管引起大出血。動脈吻合過程中要特別注意兩角的吻合,為防止漏血可貼近兩角固定線處縫合第一針,動脈吻合時每邊4-5針即可,避免縫合過密或收線太緊引起吻合口狹窄。由于靜脈壁很薄,應(yīng)注意辨認(rèn)前后壁,靜脈吻合時需輕柔,靜脈吻合時收線不宜過緊,每邊5-6針即可,最終打結(jié)時宜松不宜緊。開放血運(yùn)后,對于吻合口少量滲血,可用棉簽壓迫片刻,效果較好。

3.3 圍手術(shù)期的其他處理

整個手術(shù)過程中,術(shù)野移植心、腸管等處均需鹽水紗布覆蓋,并不時滴加冰鹽水,以保護(hù)組織。術(shù)后小鼠應(yīng)處于溫暖環(huán)境,促進(jìn)其蘇醒。

3.4 移植心功能監(jiān)測

通過腹部移植心觸診監(jiān)測移植心功能,腹部操作空間大,干擾因素小,術(shù)者可每天進(jìn)行觸診,連貫記錄移植心跳動情況。心功能0級的移植心經(jīng)病理證實(shí),均出現(xiàn)不同程度的排斥反應(yīng),而心功能4-3級的移植心未見明顯炎性細(xì)胞浸潤。說明通過腹部移植心觸診的方法監(jiān)測移植心功能,是一種準(zhǔn)確且有效的方法。

[1]Ono K,Lindsey ES.Imp roved technique of heart transplantation inRats[J].J Thorac Cardiovasc Surg,1969,57(2):225.

[2]Chen HA.New technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice[J].Transplantation,1991,52(6):1099.

[3]Steinbruchel DA,Nielsen B,Salomon S,et al.A new model forheterotopic heart transplantation in rodents[J].Transplantation Proceedings,1994,(26):1298.

[4]Demir Y,Chen Y,Metz C,et al.Cardiac allograft rejection in the absence of macrophage migration inhibitory factor[J].Transplantation,2003,76(1):244.

[5]Chen Y,Demir Y,Valujskikh A,et al.Antigen location contributes to the pathological features of a transplanted heart graft[J].Am J Pathol,2004,164(4):1407.