C5-siRNA對乳鼠心肌細胞缺氧復氧損傷的保護作用

何志紅,吳素華,蘇德華,唐,成伶俐

(1.鹽步醫院心內科,廣東佛山528247;2.中山大學附屬第一醫院心內科;3.贛南師范學院體育學院)

心肌缺血再灌注(myocardial ischemia and reperfusion,MI/R)損傷是指缺血心肌組織在恢復血液灌注后發生的細胞死亡或功能降低進一步加重。一般認為,參與心肌缺血再灌注損傷的主要因素有氧自由基、補體系統、中性粒細胞和鈣超載。既往比較重視氧自由基、鈣超載和中性粒細胞。但近來的研究發現,補體系統激活后產生的各種補體成分在心肌缺血再灌注損傷中起著相當重要的作用。大量在體實驗已經證實抑制補體可以明顯減輕心肌缺血再灌注損傷。缺血和缺氧有著及其相似的病理改變和發病機制。本研究采用離體培養的乳鼠心肌細胞建立缺氧/復氧(hypoxia-reoxygenation,H/R)損傷模型,模擬在體心肌缺血再灌注損傷,應用RNA干擾技術通過C5-siR NA特異性地抑制C5表達,從而探討其對心肌細胞缺氧/復氧損傷的影響。

1 材料與方法

1.1材料攜帶C5-siRNA的慢病毒(美國Santa Cruz biotechnology公司提供)。新生5 d SD大鼠【由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供,合格證號:S CXK(粵)2008-0020】。普通PCR儀:MyCycler(美國 BIORAD公司生產)。酶標儀 :MK3(芬蘭LAB公司提供)。細胞培養箱:美國THERMO公司生產的3110。CCK-8試劑由TONGREN公司提供。RT試劑:加拿大fermentas公司提供。

1.2方法

1.2.1心肌細胞的培養 取5日齡Wistar大白鼠乳鼠放入0.1%新潔爾滅浸泡后用針頭固定于泡沫板上,開胸取心放入D MEM液中。剔除心臟周邊的血凝及纖維組織 ,置于 另一D MEM培養皿中。將心臟剪成1mm3的碎塊,用300目網篩研磨濾過,沖洗3 000 rpm離心取沉淀后,取0.25%胰酶0.3 g/L膠原酶3 ml 37℃消化10 min,加完全培養基終止消化,3 000 rpm離心取沉淀細胞用含青鏈霉素、10%FBS的DMEM完全培養基接種于100 mm的培養皿中,37℃、5%的CO2飽和濕度下培養過夜帖壁,待鋪滿90%底面積后,平均接種于6孔板中。

1.2.2心肌細胞分組造模 各組細胞均換用低氧(3%O2。、5%CO2、92%N2)培養箱中預飽和30 min的無血清DMEM培養基。H/R組、H/R+C5-siRNA組,H/R+空載體病毒組均于37℃,3%O2、5%CO2、92%N2環境中培養2 h后放入常氧培養箱中繼續培養4 h,造成H/R損傷。其中H/R+C5-siRNA組及H/R+空載體病毒組在缺氧前2 h予C5-siR NA及空載體病毒(1.0×106IFU)。對照組于常氧環境下持續培養。將培養的心肌細胞隨機分為4組:對照組、H/R組、H/R+C5-siRNA組,H/R+空載體病毒組。

1.2.3心肌存活情況檢測(CKK-8 OD值)細胞對數增殖期用0.25%胰蛋白酶消化后按每孔1×104接種96孔細胞培養板,平行做8孔 ,各孔按設計加入試劑后按上述條件培養,顯微鏡下觀察各組細胞,棄上清,加入CCK-8溶液。選擇波長450 nm波長,用酶標儀測定各孔OD值。

1.2.4C5的測定 采用RT-PCR法從RNA水平測定C5的表達量及采用Western Blot法從蛋白質水平測定C5的含量。根據 C5基因序列,引物設計序列如下:上游引物:5′-TCAAATGTGACGGTGCTAAA-3′、下游 引 5′-TCAGGTATTCTCCCACAAGC-3′;目的基因為172 bp。 內參GAPDH 上游引物:5′-TGCCCAGAACATCATCCCT-3′、 下 游 引 物:5′-GGTCCTCAGTGTAGCCCAAG-3′目的基因為233 bp。以上引物由深圳市欣海凌生物科技有限公司合成。由上海英駿生物技術有限公司合成。

PCR反應參照Promega公司R T-PCR試劑盒說明書進行,PCR擴增條件的設置:94℃4分鐘;94℃20秒58℃30秒 72℃30秒循環28次,以GAPDH為內參,分析比較各組灰度值。取擴增終產物10μ l,在含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠上電泳,紫外光下觀察。

1.2.5統計學處理 所有實驗數據均以s表示。計量數據采用SPSS13.0統計軟件進行方差分析及組間q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1C5-siRNA對心肌存活情況的影響H/R+C5-siRNA組OD值明顯高于H/R組及H/R+空載體病毒組(表1),P＜0.05,提示C5-siRNA對心肌細胞H/R損傷有保護作用。

表1 對心肌增殖情況(OD均值)的影響

2.2RT-PCR法測定C5 RNA的表達量H/R+C5-siRNA組灰度值明顯低于H/R組及H/R+空載體病毒組(圖1)。

圖1 各組C5 RNA PCR擴增圖

2.3Wenstern Blot法測定C5蛋白的表達量H/R+C5-siRNA組灰度值明顯低于H/R組及H/R+空載體病毒組(圖2)。

圖2 各組C5蛋白的電泳圖

3 討論

自從上世紀60年代以來,國內外大量研究證實補體系統是參與心肌缺血再灌注損傷的重要因素。Hill和Ward首次在鼠的心肌梗死區中發現補體C3,并認為補體系統激活是參與缺血再灌注損傷的一重要因素[16]。Yasojima等[15]對兔離體心臟進行Langedorf灌流首次證明心肌組織自身能夠表達補體基因和蛋白且其對心肌缺血性損傷的程度起主要作用。這也為我們的離體研究提供了理論依據。

補體系統是由近30種可溶性蛋白質和膜結合蛋白(C1q,C3b,iC3b,C3a,C5a,C5b-9等)組成的多分子系統。正常生理狀態下的補體系統是人體免疫系統的一個重要組成部分,其主要功能為啟動免疫反應、溶解病原體,促進吞噬及組織的修復等。補體激活級聯反應產生一系列生物活性物質,包括早期激活產物(如C3b、C3a和 iC3b)和晚期激活產物(如C5a,C5b-9)。早期產物如C3b主要發揮調理作用和促進吞噬,對維持機體正常免疫功能至關重要。補體激活晚期產物如C5a的促炎作用和攻膜復合物C5b-9的溶細胞作用是加重組織損傷的關鍵因素[7,8]。基于上述原因,抗補體治療的理想靶點是阻斷補體晚期激活產物的產生,因而在我們的研究中,選擇C5水平為阻斷位點,依然保留C5上游的補體級聯反應,從而一方面使機體必要的免疫功能得以最大程度的保留,另一方面又可以抑制C5下游晚期產物C5a,C5b-9的形成,達到保護缺血組織的目的。

本實驗結果表明,C5-siRNA對缺氧-復氧心肌損傷有顯著保護作用,C5-siRNA能特異性抑制C5-RNA表達,進而使C5表達量下降,抑制了C5下游級聯反應,使過敏毒素C5a和鞏膜復合物C5b-9明顯減少,從而達到減輕心肌缺血再灌注損傷的目的。我們前面在在體實驗中已經證明C5-siR NA在MI/R中的保護作用,通過離體實驗我們進一步證實了C5-siRNA在MI/R的特殊地位,相對傳統的補體阻斷劑,它具有特異性高,穩定性強,高效能等優點。基于上述原因及我們在體內外實驗的研究結果,我們推測C5-siRNA有望成為一種理想的補體阻斷劑而用于臨床。

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