北京地區(qū)番茄黃化曲葉病毒病的鑒定及防治對策

周 濤, 師迎春, 陳笑瑜, 范在豐

(1.中國農(nóng)業(yè)大學植物病理學系,農(nóng)業(yè)部植物病理學重點實驗室,北京 100193;2.北京市植物保護站,北京 100029)

番茄黃化曲葉病毒病是危害世界許多地區(qū)番茄生產(chǎn)的一種毀滅性病害,分布廣泛,已給熱帶和亞熱帶地區(qū)的番茄生產(chǎn)造成嚴重損失。近年來該病在我國由南向北快速擴展,浙江、廣東、廣西、上海、江蘇、山東、安徽等地均報道發(fā)生[1-9],2009年在北京市大興區(qū)發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)典型黃化曲葉癥狀的番茄植株[10]。該病的典型癥狀為葉片變小黃化,卷曲,邊緣亮黃色,節(jié)間縮短,植株矮化,花朵減少,開花延遲,坐果少而小,成熟期果實轉(zhuǎn)色不正常,且成熟不均勻。該病在番茄生長各階段均可發(fā)生。苗期發(fā)病,植株嚴重矮縮,不能開花結果,造成絕收;植株生長后期發(fā)病,上部葉片和新芽表現(xiàn)典型黃化卷曲癥狀,坐果急劇減少,果小且畸形,嚴重影響產(chǎn)量和品質(zhì)。

番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)為雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)成員,寄主有番茄、曼陀羅、辣椒、菜豆、煙草等[11]。傳毒介體為煙粉虱,同時可經(jīng)嫁接傳播,不能經(jīng)機械摩擦或種子傳播。煙粉虱在作物和蔬菜以及雜草上發(fā)生十分普遍,為害茄科、葫蘆科、豆科等多種植物。煙粉虱獲毒后終生帶毒,但不經(jīng)卵傳給下一代。在保護地栽培條件下,煙粉虱在北方能夠安全越冬并周年發(fā)生,成為導致番茄黃化曲葉病快速擴展和大流行的重要原因。

北京市保護地面積達1.3萬hm2,其中番茄是保護地主栽蔬菜之一。2009年夏天在北京郊區(qū)調(diào)查番茄病毒病時,發(fā)現(xiàn)有些溫室的番茄植株表現(xiàn)典型黃化曲葉癥狀,且煙粉虱發(fā)生嚴重。采回發(fā)病番茄樣品,提取總DNA經(jīng)PCR檢測和測序鑒定為番茄黃化曲葉病毒病。這是該病毒病在北京地區(qū)發(fā)生的首次分子檢測鑒定報道。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2009年9-10月在北京郊區(qū)大興、通州、昌平、房山、密云、順義、延慶縣的日光溫室和大棚中采集表現(xiàn)典型植株矮縮、頂部葉片黃化上卷癥狀的番茄葉片樣品,整理后分別存放在4℃冰箱和-20℃冰箱。

1.2 葉片總DNA的提取

利用CTAB方法快速提取番茄葉片總DNA。取0.1g番茄葉片樣品,液氮中充分研磨,轉(zhuǎn)入2mL離心管后,加入65℃預熱的600μL2%CTAB抽提緩沖液(2%CTAB,200mmol/LTris-HCl,140mmol/LNaCl,40mmol/LEDTA,1%PVP,pH8.0),混勻后于 65 ℃溫育30min,再用 600μL氯仿抽提兩次后,上清液中加入等體積的異丙醇,取沉淀經(jīng) 70%乙醇洗滌,干燥后溶于 TE中,于-20℃保存。

1.3 PCR擴增、克隆和序列測定

根據(jù)謝艷等[12]報道的檢測粉虱傳雙生病毒的簡并引 物 PA(5′-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3′)和 PB(5′-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3′)(K=G或T;W=A或T;V=A,C或G;S=C或G;Y=C或T;R=A或G;B=C,T或G)進行PCR,擴增雙生病毒基因間隔區(qū)和部分外殼蛋白基因約500bp的特異片段,并進行克隆和序列測定。

建立25μLPCR反應體系：番茄葉片總DNA 2 μL,dNTPs(10mmol/μL)0.5 μL,上游引物 PA 、下游引物PB各0.5μL,10×反應緩沖液2.5μL,Taq DNA 聚合酶0.25μL(5U/μL),ddH2O18.75μL。

PCR反應條件：94℃變性2min,按下列條件進行32個循環(huán)(94℃變性30s,55℃復性45s,72℃延伸30s),72℃延伸10min。全部PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后,切取約500bp的目標條帶,用凝膠回收試劑盒回收純化后,克隆到pMD18-T載體(TaKaRa)。陽性克隆經(jīng)驗證后送華大基因公司測序。

1.4 序列分析

利用 NCBI序列比對工具 BLAST(http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/)程序 nucleotideblast比對分析克隆獲得的序列,根據(jù)相似性明確病毒種類。

2 結果與分析

2.1 樣品檢測

以提取的總DNA為模板,利用粉虱傳雙生病毒通用引物PA/PB進行PCR檢測,結果是表現(xiàn)典型癥狀的番茄樣品均擴增出約500bp的條帶,和TYLCV陽性對照樣品的擴增結果一致(圖1)。共檢測了25個番茄樣品,其中21個樣品帶有雙生病毒,檢出率為84%。結果表明北京市郊區(qū)種植的番茄已被煙粉虱傳播的雙生病毒侵染危害。

圖1 部分表現(xiàn)癥狀番茄葉片的PCR檢測結果

2.2 TYLCV北京分離物部分序列分析

將PCR擴增得到的約500bp的片段回收,克隆到pMD18-T載體并進行序列測定。利用NCBI網(wǎng)站上BLAST程序nucleotideblast進行序列相似性檢索和分析的結果表明：在檢測為陽性的來自北京郊區(qū)的番茄樣品DNA中擴增得到的雙生病毒基因組部分序列,與番茄黃化曲葉病毒分離物JSNJ1和XH2(Gen-Bank登錄號分別為FN293161.1,GU111505.1)的序列相似性最高,均為99%,表明北京郊區(qū)溫室種植番茄已被番茄黃化曲葉病毒感染而導致番茄黃化曲葉病的發(fā)生。

3 防治對策討論

利用PCR方法從北京郊區(qū)7個區(qū)縣采集的番茄樣品中檢測到了番茄黃化曲葉病毒,該分離物的部分序列與已登錄GenBank的分離物JSNJ1和XH2(GenBank登錄號分別為FN293161.1,GU111505.1)的序列相似性最高,均為99%,說明番茄黃化曲葉病已經(jīng)在北京局部發(fā)生,這是該病在北京地區(qū)發(fā)生的首次正式報道。進一步的病情、發(fā)生原因和更廣泛的調(diào)查正在進行中。

根據(jù)所獲得的北京分離物的序列和比對結果,初步判斷北京發(fā)生的番茄黃化曲葉病毒病可能來自于從我國南方調(diào)運的帶毒番茄幼苗。另外,北京周年從南方調(diào)運的大批花卉苗木上也有攜帶病毒和帶毒煙粉虱的可能性。以帶毒幼苗和帶毒煙粉虱為侵染源,經(jīng)煙粉虱取食擴散導致番茄黃化曲葉病在北京發(fā)生。近幾年,北京大面積推廣保護地栽培生產(chǎn)模式,煙粉虱得以在保護地內(nèi)安全越冬和周年發(fā)生。如不嚴加防控,可導致該病的快速傳播和大面積流行。

防治病毒病最有效的方法是培育、種植抗病品種,而目前我國生產(chǎn)上推廣的番茄品種都不抗該病毒病。國外有些品種具有高抗特性,又不適合中國人的口味。因此,從長期來考慮務必要培育符合中國人口味的抗病品種。短期內(nèi)防治的關鍵是加強田間栽培管理措施和防治煙粉虱。具體可以參考以下措施：

(1)培育無蟲無病幼苗

由于苗期感病后,不僅造成發(fā)病植株絕收,且成為植株間快速傳播的毒源,所以務必培育無粉虱無病毒病的番茄幼苗。育苗床應與生產(chǎn)大田分開,苗床盡量選用近年來未種過茄科和葫蘆科作物的土壤,對育苗基質(zhì)及苗床土壤進行消毒處理,以減少蟲源;采用40～60目防蟲網(wǎng)隔離育苗以避免苗期感染病毒;苗床內(nèi)在植株頂端高度下5cm懸掛黃色黏蟲膠板,誘殺煙粉虱以減少傳毒媒介。移栽前7d棚室殺蟲處理。

對外地調(diào)運的幼苗,特別是從發(fā)病區(qū)調(diào)運的幼苗,務必在調(diào)運前委托具有病毒檢測能力的大學等研究機構進行抽樣快速檢測,若幼苗中檢測到該病毒,建議不要調(diào)運。

(2)強化田間防控措施

幼苗移栽前全棚內(nèi)殺蟲處理,棚室所有通風處均使用40～60目防蟲網(wǎng)覆蓋,門口設置緩沖門道,內(nèi)外門錯開并且避免同時開啟。以防帶毒的煙粉虱進入棚室內(nèi)。

發(fā)現(xiàn)病株或疑似病株,務必及時拔除深埋(＞40cm)。及時清除田間雜草和殘枝落葉減少蟲源和毒源。發(fā)病初期,癥狀可能與缺素癥、普通花葉病毒病相混淆而引起更嚴重的損失,務請及時與當?shù)刂脖２块T聯(lián)系。

促進番茄植株健壯生長,增施磷鉀肥,保持田間濕潤,肥水管理要少量多次,提高植株耐病能力。適當調(diào)整種植時間,由于煙粉虱在早春4～5月份從溫室遷飛到露地為害,秋季9～10月份從露地遷回溫室越冬為害,因此調(diào)整幼苗移栽時間以避免苗期染毒,減輕病害發(fā)生。

由于煙粉虱繁殖能力強,擴散迅速,具有突發(fā)性、爆發(fā)性和毀滅性為害等特點,建議植保部門在集中連片種植番茄和相關茄科、葫蘆科和豆科作物的地區(qū)進行統(tǒng)防統(tǒng)治,減少發(fā)病和未發(fā)病田塊之間的煙粉虱近距離傳播從而提高防治效果。冬季或春季種植番茄,氣溫較低,煙粉虱發(fā)生少,活動性不強,是控制該病傳播和徹底防治煙粉虱的最佳季節(jié)。

生產(chǎn)中如遇蟲口上升迅速需及時采用藥劑應急防治,可選用25%噻蟲嗪水分散粒劑5000～6000倍液噴霧或25%噻嗪酮可濕性粉劑1500倍與2.5%聯(lián)苯菊酯乳油3000倍混合噴霧。噴藥時務必均勻噴到葉片正面和背面,特別著重對葉片背面噴藥。因煙粉虱繁殖力強,極易產(chǎn)生抗藥性,需要幾種藥劑交替混配使用。氣溫較高或保護地內(nèi)溫度較高時,煙粉虱活動活躍,一般5～7d噴藥1次,溫度較低時可10～15d防治1次。

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