結核分枝桿菌耐氧氟沙星臨床分離株gyrA基因突變的研究

閆麗萍, 肖和平, 鄭瑞娟, 胡忠義, 樂 軍, 景玲杰

為了解結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)耐氧氟沙星臨床分離株gyrA基因突變與氟喹諾酮類藥物接觸史的關系,我們隨機篩選20株耐氧氟沙星的MTB臨床分離株行gyrA基因喹諾酮耐藥決定區(quinolone resistance-determining regions,QRDR)序列測定,并調查這20株菌株的氟喹諾酮類藥物接觸史,現將結果報道如下。

材料與方法

一、材料

(一)MTB臨床分離株 2007年8月—2008年5月自上海市肺科醫院收治的肺結核患者痰標本分離、篩選出的耐氧氟沙星菌株,共20株,其中3株嚴重耐多藥(extensive-drug resistant,XDR),14株耐多藥(multi-drug resistant,MDR),1株多耐藥(poly-drug resistant,PDR),2株單耐氧氟沙星;H37Rv為試驗對照用標準MTB菌株。

(二)抗菌藥物 鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇(均為美國BD公司產品)、卷曲霉素(浙江海正藥業股份有限公司)、阿米卡星(上海旭東海普藥業有限公司)和氧氟沙星(日本第一制藥株式會社)。

(三)培養基 PNB鑒別培養基、TCH鑒別培養基、改良7H9液體培養基。

二 、方法

(一)痰標本MTB的分離、培養與鑒定 參照《結核病診斷細菌學檢驗規程》[1]。

(二)MTB的藥物試驗 應用BACTEC-960法檢測搜集的MTB臨床分離株對鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇、卷曲霉素、阿米卡星和氧氟沙星的敏感性,根據BACTEC-960的操作手冊,上述藥物所采用的濃 度 分別 為 ：1.0、0.1、1.0、5.0、1.0、2.5、2.0 mg/L,耐藥百分率大于1%則認為受試菌對該藥物耐藥。

(三)H37Rv和耐氧氟沙星的MTB臨床分離株DNA提取與gyrA目的片段285 bp的擴增、測序采用經典的酚∶氯仿∶異戊醇法提取M TB全染色體DNA作為模版,基因擴增在美國ABI2720 themo cycler PCR儀上進行,引物序列為 P1 5'-CAG CTA CAT CGA CTA TGC GA-3'、P2 5'-GGG CTT CGG TGT ACC TCA T-3'。熱循環為94℃預變性4 min,然后按94℃1 min,60℃1 min,72℃1 min,循環40個周期,進行PCR產物電泳(見圖1)。擴增產物經乙醇純化后與引物P1和四色熒光標記試劑(美國PE公司提供)混勻,按94℃1 min,55℃2 min,72℃4 min,循環 30個周期。在美國ABI3130XL型 genetic analyzer測序儀上測序(見圖2)。

結 果

H37Rv gyrA的QRDR測得序列與美國國立生物信息中心核酸數據庫已登錄的H37Rv株序列完全一致[2]。與H37Rv株序列的差異比較顯示20株臨床株的gyrA第95位密碼子均為ACC(H37Rv為AGC),為天然的多態現象[3]。18株存在有義突變,突變率為90%。其中2株第91位密碼子由TCG(絲氨酸)→CCG(脯氨酸),3株第90位密碼子由CCG(脯氨酸)→GTG(纈氨酸),10株第94位密碼子由GAC(天冬氨酸)→GGC(甘氨酸),2株第94位密碼子由GAC(天冬氨酸)→GCC(丙氨酸),1株第94位密碼子由GAC(天冬氨酸)→GTC(纈氨酸),其中以第94位密碼子的GAC(天冬氨酸)→GGC(甘氨酸)最為多見。

20株菌株的耐藥類型及既往氟喹諾酮類藥物應用情況：既往未應用過氟喹諾酮類藥物6例,均為MDR(其中2例初治,2例初治復發,2例初治失敗)。2例曾在結核確診前應用氟喹諾酮類藥物經驗性抗感染治療1周患者,為單耐氧氟沙星(均為初治病例)。12例曾聯合應用氟喹諾酮類藥物抗結核治療(1例為初治復發,11例為多次治療失敗或復發)患者,其中4例為XDR,7例為MDR,1例為PDR,見表1。20株MTB臨床分離株的耐藥譜見表2。

表1 不同FQs接觸史的菌株gyrA的QRDR突變情況Table 1.QRDR mutations in gyrA of strains with different fluoroquinolones exposure history

表2 20株M TB臨床分離株的耐藥譜Table 2.Antibiotic resistant pattern of 20 clinical isolates of M.tuberculosis

討 論

氟喹諾酮類藥物主要通過抑制DNA旋轉酶A(gyrase A)亞單位與DNA的結合,從而抑制結核菌DNA的復制與表達,達到對M TB的殺滅作用[4]。gyrA是DNA旋轉酶A亞單位的編碼基因,它的突變導致氟喹諾酮類藥物無法與DNA旋轉酶A亞單位結合,使MTB對氟喹諾酮類藥物產生耐藥[5]。本次實驗的20株耐氧氟沙星MTB臨床株中共18株發現了有義突變,分別在第90例、91和94位密碼子上。未發現有文獻報道的第88位[6]及74位[7]密碼子的突變,也未發現在同一株MTB上存在gyrA雙突變的情況[8]。本實驗中有2株氧氟沙星耐藥株(10%)未發現gyrA突變,提示gyrA突變不是MTB耐氟喹諾酮類藥物唯一的機制。Kocagoz等[8]曾對未發現 gyrA突變的菌株行gyrB檢測,發現了gyrB上第495位密碼子的突變。另外還有研究者提出泵蛋白對藥物的泵出作用[9]及細胞外膜對藥物的通透性降低[10]、細菌適應藥物環境的調節機制(如毒素-抗毒素系統)[11]均可導致MTB對氟喹諾酮類藥物耐藥。最近,研究人員又在MTB中發現了一種能夠模擬DNA的蛋白質MfpA[12],其表達使M TB對環丙沙星和司帕沙星產生耐藥,這可能是解釋氟喹諾酮耐藥的新機制。而本次實驗中的2株無gyrA突變的氧氟沙星耐藥株對氧氟沙星的耐藥機制尚不明確,有待進一步的研究。但通過本實驗可以明確的是gyrA突變是MTB對氟喹諾酮類藥物耐藥的主要機制,且以其第90、91和94位密碼子的有義突變為主。

關于氟喹諾酮類藥物誘發gyrA突變的時間折點問題目前的報道則更少。在本次研究中有2例初治患者僅于肺結核確診前接受1星期的氟喹諾酮類藥物經驗性抗感染治療,確診后的首次藥敏試驗即出現了單獨對氧氟沙星的耐藥及MTB gyrA的突變。由此看來極有可能單一應用氟喹諾酮類藥物1周即可產生誘發gyrA的突變。但由于本次實驗未收集到這2例患者應用氟喹諾酮類藥物前的菌株,故此結論暫時還不能成立,但仍建議臨床醫師在結核病不能完全排除時經驗性抗感染治療應避免使用氟喹諾酮類藥物。

本次研究還發現6例未應用過氟喹諾酮類藥物的患者對氧氟沙星耐藥,且這6株均為MDR菌株。臨床病例調查發現這6例患者均為初治或首次復治患者,故考慮這些患者很可能是感染了耐氧氟沙星的MDR菌株。其中5株也仍存在gyrA突變,提示gyrA突變具有一定的穩定性,在停止接觸氟喹諾酮類藥物后并持續傳代的過程中不易恢復敏感性。

通過本次實驗,我們得到以下啟示：gyrA基因突變是MTB對氟喹諾酮類藥物產生耐藥的機制之一;gyrA基因的有義突變主要發生在第90、91和94位密碼子上。

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