酶聯(lián)免疫斑點試驗檢測技術(shù)在血液病合并痰涂片抗酸桿菌陰性結(jié)核病診斷中的應(yīng)用

葉麗萍, 梁 艷, 施 兵, 劉麗輝, 金建剛, 張玉珠, 胡文清, 劉明娟,陽幼榮, 陳 虎, 吳雪瓊

2.全軍結(jié)核病研究所;

3.軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院造血干細胞移植中心。

結(jié)核分枝桿菌是一種細胞內(nèi)寄生菌,抗結(jié)核免疫主要是細胞免疫,由于血液病患者自身免疫功能低下,應(yīng)用化療或免疫抑制劑治療導(dǎo)致骨髓抑制,使機體免疫功能進一步下降,易合并各種感染,特別是結(jié)核分枝桿菌感染。血液病患者患結(jié)核病時的臨床癥狀不典型,而傳統(tǒng)的診斷結(jié)核病的檢測方法,大多數(shù)呈陰性反應(yīng),使醫(yī)師憑經(jīng)驗給予診斷性抗結(jié)核治療,可能給患者增加了藥物不良反應(yīng)的風險。近年來國內(nèi)、外用酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT)檢測免疫功能低下患者合并活動性結(jié)核,有很好的敏感性及特異性[1-4]。因此,近2年來我們用全軍結(jié)核病研究所研制的ELISPOT試劑盒,通過檢測外周血中分泌IFN-γ的單個核淋巴細胞,以傳統(tǒng)的診斷方法為對照對我科2006年6月—2008年10月間住院的415例血液病患者,其中105例發(fā)熱痰涂片抗酸桿菌陰性懷疑合并活動性結(jié)核的患者,進行了檢測,并對105例中臨床確診的24例結(jié)核患者及27例排除結(jié)核的患者共51例的臨床資料進行了回顧性分析,現(xiàn)報道如下。

材料與方法

一、觀察對象

檢測了105例發(fā)熱痰涂片抗酸桿菌陰性懷疑合并活動性結(jié)核的患者,非血液病、臨床及檢驗結(jié)果不全、中性粒細胞低(＜1.0×109/L)或血標本有凝塊、操作失誤等因素排除后,分析了51例。確診血液病[5]合并活動性結(jié)核[6]的患者24例,其中男16例、女8例,中位年齡40歲(11～70歲),有結(jié)核病史的9例,1例急性白血病患兒有結(jié)核病密切接觸史;24例中惡性血液病17例,其中急性白血病12例[急性髓細胞白血病(AM L)5例中3例M2型、2例M4型,急性淋巴細胞白血病(ALL)5例,混合型2例,其中各含1例AML-M2型同胞移植后4年及PH+ALL無關(guān)供者移植后2個月發(fā)生結(jié)核病]、慢性髓細胞白血病(CML)急變1例、骨髓增生異常綜合征(MDS)1例、淋巴瘤(NHL)2例(1例彌漫大B細胞型Ⅲ期B、1例免疫母T細胞型Ⅳ期)、1例多發(fā)性骨髓瘤(MM)IgG型Ⅲ期A;良性血液病例7例其中骨髓纖維化1例、免疫性血小板減少性紫癜(ITP)3例(糖皮質(zhì)激素治療3年與5年各發(fā)生1例)、再生障礙性貧血(AA)2例(含1例異基因移植后29 d)、1例系統(tǒng)性紅斑狼瘡(13年溶血性貧血史長期服糖皮質(zhì)激素)(見表1)。27例排除活動性結(jié)核的患者：男19例、女8例,中位年齡40歲(14～77歲),3例有結(jié)核病史,惡性血液病22例(2例有呼吸衰竭)：急性白血病 9例、CML5例(移植后 2例)、2例 MDS、NHL1例、MM 4例、慢性淋巴細胞白血病(CLL)1例;良性血液病5例：純紅細胞再生障礙性貧血及貧血各2例、Castleman病1例。

表1 24例血液病合并結(jié)核病患者一般情況Table 1.General clinical data of the 24 patients with hematologic diseases and tuberculosis

二 、方法

(一)ELISPOT 取3～4 mL外周抗凝血,用淋巴細胞分層液分離、提純外周血單個核細胞(PBMC),調(diào)節(jié)細胞濃度至2.0×106/L。取一預(yù)包被IFN-γ捕獲單克隆抗體的微孔板,每個測試樣本需要微孔板3孔：陰性對照孔內(nèi)加入完全細胞培養(yǎng)液50 μ L,陽性對照孔內(nèi)加入陽性對照 PHA 50 μ L;在測試孔內(nèi)分別加入CFP10-ESAT6融合蛋白50 μ L。分別在上述各孔內(nèi)加100 μ L含有 2×105個PBMC的懸液,將微量板置于37℃含5%CO2孵箱中孵育20 h;棄上清液,用200 μ L ×PBS 洗板4次,每孔加入50 μ L 1∶60稀釋的IFN-γ檢測抗體,37℃孵育2 h;洗板后,每孔加入50 μ L 1∶1 000稀釋的鏈親合素-堿性磷酸酶,室溫孵育2 h;洗板后,每孔加入50 μ L新鮮配制的 BICP/NBT底物,顯色 15 min;可見板底顯示紫色斑點,用蒸餾水洗板中止反應(yīng)。每1個點代表1個分泌IFN γ的T細胞,應(yīng)用CTL公司酶聯(lián)斑點分析儀計數(shù)著色的斑點。當陰性對照孔點數(shù)＜8,檢測孔點數(shù)減去陰性對照孔點數(shù)≥8,可判斷所檢測標本為陽性;如果陰性對照孔點數(shù)≥8,檢測孔點數(shù)為陰性對照孔2倍,可判斷所檢測標本為陽性。

(二)結(jié)核菌素皮膚試驗 左前臂1/3處內(nèi)側(cè)皮內(nèi)注射0.1 mL(5 u)的結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PPD),出現(xiàn)皮丘注射成功,72 h后測量紅腫或硬結(jié)橫縱直徑(mm),其平均值作為PPD皮試大小。若硬結(jié)的橫徑及縱徑的平均數(shù)≥5 mm為陽性。

(三)抗結(jié)核抗體檢測 取外周不抗凝血2～3 mL,1～2 h后3 000 r/min離心15 min,取上清液用于抗結(jié)核抗體檢測。聯(lián)合檢測3個抗結(jié)核抗體,所用抗原分別為阿拉伯甘露聚糖、結(jié)核分枝桿菌活動期產(chǎn)生的38×103u蛋白及16×103u蛋白。嚴格按試劑盒提供的步驟操作。檢測的血或(和)痰及體液標本≥2項陽性為檢測陽性。

(四)活動性結(jié)核的診斷標準

1.肺結(jié)核：按中華醫(yī)學會結(jié)核病學分會制定的肺結(jié)核診斷和治療指南診斷[6]。

2.肺外結(jié)核：①慢性中毒癥狀有發(fā)熱、盜汗、消瘦;②PPD試驗強陽性或血抗結(jié)核抗體≥2項陽性;③體液沉渣涂片抗酸桿菌陽性或結(jié)核桿菌培養(yǎng)陽性或抗結(jié)核抗體≥2項陽性;④影像學檢查具有結(jié)核的特點;⑤組織活檢病理證實;⑥試驗性抗結(jié)核治療有效。凡符合上述≥3項者診斷為肺外結(jié)核。

三、統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用t檢驗;多變量間的相關(guān)性用logistic回歸軟件進行相關(guān)性分析。

結(jié) 果

一、血液病合并活動性結(jié)核的患者結(jié)核相關(guān)試驗結(jié)果

臨床確診24例合并活動性結(jié)核患者中：PPD陽性6例、陰性5例(用免疫抑制劑13例未查);抗結(jié)核抗體檢測陽性9例、陰性15例;ELISPOT陽性14例(未查3例)、陰性5例(其中2例淋巴細胞數(shù)＜0.5×109/L)(見表2)。PPD陰性的 3例中ELISPOT均陽性,1例 ELISPOT陰性而 PPD陽性;3例ELISPOT陰性患者中抗結(jié)核抗體均陽性(2例為淋巴細胞數(shù)低);9例抗結(jié)核抗體陰性患者中,ELISPOT試驗均陽性。

二、血液病排除活動性結(jié)核患者其結(jié)核的相關(guān)試驗結(jié)果

27例(23/27肺部感染占85.2%)中PPD陰性11例、陽性1例(用免疫抑制劑15例未查);抗結(jié)核抗體陰性21例、陽性3例(未查3例);ELISPOT陰性24例、陽性3例(見表2)。ELISPOT假陽性率11.1%,PPD 8.3%及抗結(jié)核抗體12.5%,三者差異無統(tǒng)計學意義(見表3);3項均陽性或任意2項陽性的患者均為0。1例PPD陽性患者抗結(jié)核抗體及ELISPOT均陰性,3例抗結(jié)核抗體陽性患者中2例ELISPOT均陰性,3例ELISPOT試驗陽性患者中2例抗結(jié)核抗體均陰性。

三、ELISPOT靈敏度、準確度評價

ELISPOT的靈敏度(73.6%,14/19)高于抗結(jié)核抗體試驗(37.5%,P=0.0047)和PPD皮膚試驗(54.5%,P=0.0351);ELISPOT的準確度(82.6%,38/46)高于抗結(jié)核抗體(62.5%,P=0.0447)和PPD皮膚試驗(77.8%)(見表3)。

四、ELISPOT的特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值評價

ELISPOT的特異度(88.9%)與抗結(jié)核抗體(87.5%)及 PPD(93.8%)相似;陽性預(yù)測值(82.4%,14/17)略高于抗結(jié)核抗體(75.0%,9/12),與PPD(85.7%)相似;以上差異均無統(tǒng)計學意義。陰性預(yù)測值82.76%,高于抗結(jié)核抗體 58.3%(P=0.0421)差異有統(tǒng)計學意義,略高于PPD 75.0%(見表3)。

五、血液病懷疑活動性結(jié)核診斷進行l(wèi)ogistic回歸相關(guān)性分析

表2 血液病合并結(jié)核病24例及27例排除結(jié)核病患者的ELISPOT、抗結(jié)核抗體與PPD試驗Table 2.The diagnostic results of ELISPOT,PPD and anti-TB antibodies in hematologic patients with(24)or without(27)tuberculosis

表3 血液病合并結(jié)核患者ELISPOT、抗結(jié)核抗體與PPD試驗結(jié)果比較Table 3.Utility of ELISPOT,PPD and anti-TB antibodies in patients with both hematologic diseases and tuberculosis

對51例患者性別、年齡、結(jié)核病史或接觸史、熱型、影像學、血象(特別是淋巴細胞計數(shù))、紅細胞沉降率、C反應(yīng)蛋白、抗結(jié)核抗體、ELISPOT、PPD試驗、B超及影像學等多因素分析后發(fā)現(xiàn),活動性結(jié)核只與ELISPOT、PPD、抗結(jié)核抗體、肺CT、結(jié)核史 5項相關(guān)(見表4)。

表4 對51例血液病懷疑結(jié)核診斷數(shù)據(jù)進行l(wèi)ogistic回歸相關(guān)性分析Table 4.Logistic regression analysis of the factors associated with the tuberculosis in 51 patients with hematologic diseases

討 論

急性白血病合并結(jié)核患病率報道不一,在1.2%～20%以上不等[7]。我國人群中活動性肺結(jié)核發(fā)病率為367/10萬[8],本研究血液病合并活動性結(jié)核發(fā)生率為24/415(5.7%),約為該發(fā)病率的15.5倍,與嚴云等[9]報道5%相近。24例合并結(jié)核病患者中有結(jié)核病史9例占37.5%,另有1例為密切接觸者。24例中惡性血液病17例占70.83%,初診時發(fā)病7例,治療后10例,其中2例造血干細胞移植后發(fā)病、1例CML加速期發(fā)病。17例中肺結(jié)核8例,肺外結(jié)核9例(累積胸膜8例、心包1例,≥2部位6例)。24例中良性血液病 7例,占29.16%,有 6例長期使用免疫抑制藥物(糖皮質(zhì)激素或CSA、1例為sAA造血干細胞移植后早期發(fā)生)、1例初診時合并。發(fā)生肺結(jié)核2例、肺外結(jié)核5例,均為結(jié)核性胸膜炎。良、惡性血液病肺外結(jié)核均＞50%。

在27例血液病排除活動性結(jié)核的患者中,肺部感染占85.2%(3例有結(jié)核病史),病理檢查后排除8例,試驗性抗結(jié)核治療結(jié)合相關(guān)試驗后排除9例,抗感染治療(細菌、真菌、病毒)后好轉(zhuǎn)排除其余患者。

由于我組24例患者均為痰涂片抗酸桿菌陰性結(jié)核,沒有典型的結(jié)核病癥狀,以結(jié)核性胸膜炎為主。因自身免疫功能低下,大部分患者長期用免疫抑制劑,PPD試驗陰性占多數(shù),同時合并其他感染(細菌、真菌、病毒)10/24(41.66%),患者的全血細胞減少又造成取病理難,不能依據(jù)結(jié)核病診斷標準確診(痰涂或培養(yǎng)陽性及病理診斷),使誤診率較高。從本研究結(jié)果中就可看出常用的PPD試驗(13例用免疫抑制劑而未查)與抗結(jié)核抗體試驗在此類患者中陽性率低,而ELISPOT較上述2項試驗陽性檢出率高。

Mahairas等[10]在1996年發(fā)現(xiàn)的一段存在結(jié)核分枝桿菌中名為“RD1”的基因序列,而在卡介苗菌株和大部分環(huán)境中的分枝桿菌基因中則缺乏RD1序列;RD1編碼產(chǎn)生2種蛋白：ESTA-6和CFP-10,這2種蛋白作為特異性抗原刺激機體特異性 T細胞產(chǎn)生IFN-γ。

本研究結(jié)果進一步證實了血液病痰涂片抗酸桿菌陰性患者的活動性結(jié)核診斷困難,特別是結(jié)核相關(guān)試驗陽性率低;而ELISPOT作為一種新的檢測結(jié)核的酶免疫學方法,其靈敏度與準確度顯著高于傳統(tǒng)的試驗方法,試驗需時少(2 d)、對隱性活動性結(jié)核有診斷價值,可排除因接種卡介苗PPD試驗陽性的非活動性結(jié)核感染的人群;但受淋巴細胞計數(shù)及操作者技能等因素的影響。如果ELISPOT與抗結(jié)核抗體、PPD試驗相聯(lián)合,可明顯提高此類患者結(jié)核的診斷率79.2%,臨床醫(yī)師仍需結(jié)合影像學、結(jié)核病史及抗結(jié)核治療療效綜合判斷,可使診斷率提高(≥90%)。總之,ELISPOT是血液病患者合并活動性結(jié)核的重要輔助診斷手段。

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